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1、上调p38表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】 目的 研究p38在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法 构建p38正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球体，RTPCR及Western blot分析p38表达；CCK8细胞毒性试验和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 (1)多细胞球体p38表达低于单层细胞。（2）FACS检测转染p38真核表达载体的多细胞球体经顺铂作用后，细胞凋亡率高于转染空载体和未转染的多细胞球体；（3）CCK8细胞毒性试验示转染p38真核表达载体的多细胞球体相对于转染空载体和未转染
2、的细胞球体对顺铂敏感性更高。结论 p38介导顺铂对卵巢癌化疗耐药，上调p38表达，可提高卵巢癌多细胞球体对顺铂的敏感性。 【关键词】 卵巢癌 p38 顺铂 化疗耐药 多细胞球体 p38作为MARK家族中的一员，在细胞生长、分化、细胞周期及凋亡等过程中发挥调控作用，是细胞内重要信号转导分子。肿瘤化学治疗本质即使细胞生长受抑或凋亡，然而肿瘤细胞对化疗药物的抵抗是当今肿瘤治疗的一大难题。本试验旨在探索p38分子在卵巢癌化疗耐药中的作用，为进一步阐明化疗耐药机制及提高卵巢癌对药物的敏感性提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 人卵巢癌细胞株A2780购自ECACC（European Coll
3、ection of Cell Cultures, Salisbury, UK）。细胞置于含10胎牛血清培养液RPMI1640，于37、5% CO2饱和湿度条件下培养。 1.2 试剂 p38多克隆抗体购自Cell Signaling Technology, Inc.(Beverly, MA,USA)；碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉试剂公司，RPMI1640培养液购自Gibco公司；脂质体购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自Promega公司。PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成。 1.3 方法 1.3.1 多细胞球体模型的建立 用三维培养方法(threedimensio
4、nal culture)获得A2780多细胞球体1。用无血清培养液RPMI1640将琼脂糖稀释成1.5的溶液,灭菌后在24孔板上铺一浅层，冷却后调整细胞浓度种板，约5×106/m1，0.5ml，轻轻振荡，每48h部分换液1次（2/3），5d后多细胞球体形成。 1.3.2 构建p38正义全长真核表达载体 （1）RTPCR法扩增p38全长 用于扩增p38全长cDNA的引物为，上游：5′CCC AAG CTT AAA ATG TCT CAG GAG AGG C3′，下游：5′GCT CTA GAT CAG GAC TCC ATC TCT TCT T3&
5、prime;。5′端引入HindIII酶切位点, 3′端引入XbaI酶切位点,扩增目的片段为1.3Kb。引物设计借助Oligo 6.0完成。 (2)限制性内切酶HindIII和XbaI消化质粒pEGFPC1和p38全长cDNA（PCR产物），琼脂糖凝胶回收载体片段，PCR及酶反应产物纯化试剂盒回收目的基因片段，T4DNA连接酶将目的基因片段定向克隆至真核表达载体pEGFPC1的HindIII和XbaI位点之间，使p38基因片段插入此载体中。重组体转化大肠杆菌DH5α，筛选Kan抗性克隆，命名为pEGFPC1p38，酶切鉴定重组体；脂质体Lipofectami
6、ne TM2000包裹构建好pEGFPC1p38，将A2780细胞以1×106/ml 接种6孔板，待其生长至70%80%融合时开始转染, 转染方法参考GibcoBRL操作手册, 所用pEGFPC1p38量为4.0μg/孔，脂质体10μl/孔，孵育6h后终止转染，G418筛选后三维培养形成多细胞球体（A2780/p38细胞球）。 (3)RTPCR 收集细胞，提取RNA，逆转录后行PCR。引物设计：利用引物设计软件Oligo 6.0自行设计。p38：5′GTC CCC AAT CCC GGT CAT GCT3′ 5′CGT GCA AAA
7、 CAC ATC CTC ACT3′。GAPDH：5′CCTTCACCATCTTCCAGGAG3′；5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′。将反应体系置PCR扩增仪上95预变性5min，然后开始PCR循环：94 1min，50 45s，72 1min，共30个循环，最后一个循环72延长10min。 1.3.3 Western blot 收集裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白质浓度(考马斯亮蓝G250染料法)。脱脂奶封闭2h，在10 SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳完毕后电转移至NC膜。p38抗体(11 000), 4过夜。碱性磷酸
8、酶标记二抗(1500)37孵育1h，加底物BCIP/NBT显色30min。 1.3.4 FACS检测细胞凋亡 应用流式细胞仪测定A2780球、A2780/p38细胞球的凋亡率：A2780球、A2780/p38细胞球中分别加入20μmol/L的顺铂作用24h，收集细胞，75冰乙醇20固定过夜，0.1% RNase A（1mg/ml）的PBS室温处理20min，加PI至终浓度50μg/ml，1h内检测细胞凋亡率。SubG1法分析凋亡细胞，计算凋亡率。 1.3.5 CCK8方法检测顺铂对卵巢癌A2780细胞的细胞毒性作用 A2780细胞球、A2780/p38细胞球分别以10、20、30、
9、40、50μmol /L顺铂作用24h，加入10μl的CCK8试剂，培养箱内培养，37 4h，在检测波长450nm、参考波长600nm下测定吸光度值（A值）。计算各组细胞的抑制率（Inhibit Rate）。于酶标仪上测定560nm波长的吸光度(A)值,计算抑制率(%)=(1试验孔A值/对照孔A值)×100%,并绘制浓度抑制率曲线。 1.4 统计学方法 配对t检验和方差分析，数据采用SPSS12.0软件包进行统计，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 p38真核全长表达载体构建 将构建重组质粒双酶切，证明p38真核表达载体构建成功。空载体和目的片断
10、，见图1。 图1 pEGFPC1p38真核表达载体酶切图 2.2 验证p38差异表达 RTPCR 及Western blot分析单层细胞及多细胞球体中p38差异表达，见图2。mRNA水平和蛋白质水平，单层细胞p38表达明显高于多细胞球体的表达。 2.3 稳定转染获得阳性克隆 将重组质粒pEGFPC1p38转染A2780细胞，经G418筛选获得稳定表达p38阳性克隆株，命名为A2780/ p38细胞，见图3。 2.4 稳定转染pEGFPC1p38质粒后，p38蛋白水平的变化，见图4。转染后，p38表达上调。 1：Marker; 2:单层细胞；3：多细胞球体 a: RTPCR验证p38差异表达；b
11、: Western blot验证p38差异表达 图2 p38差异表达验证图1: A2780/pEGFPC1/P38； 2: A2780/pEGFPC1; 3: A2780 图4 稳定转染pEGFPC1p38质粒后，p38蛋白表达变化 a: 光镜视野； b: 荧光视野 图3 转染后A2780/p38细胞单克隆 2.5 各组细胞对顺铂敏感性 2.5.1 FACS 检测结果 细胞凋亡率比较：FACS结果显示，A2780/p38细胞球和A2780细胞球经20μmol/L顺铂作用24小时后，后者凋亡率明显低于前者，见图5。 2.5.2 CCK8方法检测顺铂对卵巢癌A2780/p38细胞球、转染空质
12、粒及未转染细胞球的细胞毒性，见图6。不同浓度顺铂作用24h后转染p38的细胞球抑制率明显高于其他两组，且毒性呈现剂量依赖性(<0.05)。 3 讨论 卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤，其主要原因之一是卵巢癌细胞易对化疗产生耐药而导致治疗失败2, 顺铂是一种常见的抗肿瘤药物,以顺铂为主的铂类药物化疗在卵巢癌治疗中占重要地位，提高卵巢癌的化疗敏感性，降低化疗耐药尤其是对最常用的化疗药物顺铂的耐药性是改善临床预后的关键。 丝裂霉素活化蛋白激酶(MAPK)是一个重要的细胞外信号传导酶超家族, 它在肿瘤的形成、进展和转移中都扮演着重要角色，主要包括ERK3、p38 4,5和Cjun 氨基末端激酶
13、(JNK)3个亚族6,7。p38是MAPK家族重要成员,它可通过自身磷酸化而被激活，是重要的肿瘤抑制因子。持续p38活化可使肿瘤处于静止状态，而p38活性下降则可引起肿瘤增殖及生长8,9。 Losa等10发现顺铂可持续、特异性激活多株癌细胞中p38MAPK 并引发细胞毒作用，而顺铂耐药的细胞株相对于非耐药株在顺铂作用下p38活性明显减弱或缺失，经p38特异性抑制剂SKF860002预处理的肿瘤细胞在顺铂作用下表现出细胞活性增强，说明p38MAPK受抑制可能是顺铂耐药的原因。Mansouri A等11发现对顺铂敏感的细胞株在顺铂的作用下表现出JNK和p38的活性增强，而且持续的时间远高于对顺铂耐
14、药的细胞株，持续性的JNK和p38激活引起下游靶点（死亡受体FasL配体）的转录，从而诱发凋亡。 多细胞球体(MCS)是体外组织培养中获得多细胞球状聚合体，在组织结构上与实体肿瘤非常相似，是研究实体瘤的良好模型，MCS细胞耐药现象已在多种肿瘤中得到证实。本试验以单层细胞和MCS为化疗耐药配对模型，研究耐药分子机制，发现MCS的p38表达明显低于单层细胞，本研究前期实验发现顺铂作用于A2780细胞后，引起p38表达增高，而将A2780细胞作三维立体培养形成细胞球，顺铂作用后发现其p38的表达较单层细胞比较而言相对较低，提示p38可能参与了MCS对顺铂的耐药。 本试验构建p38正义表达载体转染A2
15、780细胞进行三维培养形成MCS，与转染空质粒及未转染p38的A2780细胞球相比，p38表达明显上调，经顺铂作用后，细胞凋亡率明显升高，细胞毒性试验表明顺铂对其毒性更强。这说明导入了p38的A2780细胞球与A2780细胞球相比，对顺铂更敏感,p38提高了卵巢癌多细胞球体对顺铂的敏感性。 Losa等10发现在顺铂诱导p38活化的同时，HN30细胞株中AKT活性也较高。本研究前期实验发现顺铂作用于A2780细胞后，引起p38表达增高，而Hayakawa等12发现顺铂作用下A2780细胞中AKT也被激活。由于各种信号通路之间有相互作用，除p38外AKT通路可能也参与了顺铂耐药。有研究表明Akt可
16、协助Hsp90通过抑制ASK1p38信号通路抑制细胞凋亡13。三维培养的细胞球由于细胞间相互粘附聚集而改变了肿瘤细胞的微环境而产生了耐药，其机制可能是化疗药物作用于肿瘤细胞，通过激活AKT通路而抑制了p38介导的细胞凋亡, 在后续研究中有待进一步证实。 本文探讨了卵巢癌顺铂耐药的分子机制，上调p38提高了A2780多细胞球体对顺铂的敏感性,进一步证实了激活顺铂诱导的p38MAPK通路在改善卵巢癌顺铂耐药中所起的作用。改变p38表达有可能成为卵巢癌等肿瘤治疗的新靶点，为逆转卵巢癌对顺铂的耐药提供了理论依据。【参考文献】 1 Koike C, Mckee TD, Pluen A, et al. Solid st
