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1、生物化学实验北京理工大学生命学院生物化学实验教材编写组29生物化学实验室规则1 实验前必须认真预习实验内容，了解实验的目的、基本原理和操作方法。准备好白大褂，实验讲义、油性记号笔、记录本、笔等。2 实验室中应严格遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声喧哗，严禁吸烟、吃食物。3 第一次实验前各组应按实验器材清单清点实验器材；每一次完成实验后清洗仪器，清理桌面，经老师同意后，方可离开；最后一次实验完毕后，应在清点完实验器材，填写完清单后发方可离开。4 实验过程中，必须穿白大褂。要保持实验台面仪器、药品、试剂排放整齐。要节约使用药品、试剂，避免漏洒，如有发生应及时处理。5 要爱护公物，公
2、用仪器及药品用完后要放回原处，尽量避免损坏仪器和玻璃器皿，如有损坏，应填写破损单，注明原因，并按原价赔偿。损坏的玻璃器皿及废针头应放到老师指定位置。实验完毕，须核对柜内器物无误方能离开。6 实验过程中严格按操作规程进行实验，认真、及时、如实记录实验结果。7 实验报告需写出班级、学号、姓名，实验目的，实验原理，试验内容，实验材料，实验现象，结果与讨论、思考题等（详见“生物化学实验课程内容及要求”中的“一、实验报告要求”）。8 学生轮流值日，由各班班长按老师要求根据学号安排，实验前10分钟到实验室，协助实验课前事项，包括公用仪器的检查、公用试剂的整理、试剂添加、器皿清洗。实验完毕，做好实验室环境卫
3、生，负责实验室的窗台、讲台、桌面、地面、水池、药品架等的清洁，倾倒垃圾箱中的废物，水浴锅将水排放干净，凳子排放整齐，柜子锁好，检查门、窗、水、火、电、气是否关闭。10. 成绩评定：实验报告占60%，实验表现占30%，不管何种原因，未上实验课，实验表现0分，出勤5%（缺席一次扣5%，请事假和病假一次扣3%，请公假不扣分，迟到扣1%，）和卫生5%。实验报告抄袭按不及格处理。生物化学实验课程内容及要求一、实验报告要求除电脑作图、照片外，其他内容要求手写在学校统一的实验报告纸上，各位同学之间的实验报告内容不能抄袭、雷同，否则视程度不同，以不及格论处。具体要求如下：实验题目1 实验目的 2 实验原理要求
4、理论清晰、概括性强。必须查阅相关文献资料，对相关的基础理论知识、实验方法现状及各种实验方法的比较。 3 实验材料与试剂(1)实验器材 (2)实验试剂4 实验方法要求列出实验操作注意事项，包括步骤操作注意事项及试剂、仪器安全操作注意事项5 结果与分析包括现象描述、数据、结果计算及相关图表、照片等，然后对实验结果、数据作出分析、讨论。6 思考题分析7 参考文献1 Kiepiela P, Leslie A J, Honeyborne I, et al. Dominant influence of HLA-B in mediating the potential co-evolution of HIV
5、 and HLA. Nature, 2004, 432: 769-7752 孙玉英, 孔繁华, 奚永志等. HLA-I类PCR-SSP基因分型在异基因造血干细胞移植中的应用. 中华器官移植杂志, 2001, 22(6): 326-3283 Lee J, Pillai S. Complete nucleotide sequence of MHC class I alleles in the HT29 colon cancer cell line. Tissue Antigens, 1993, 42: 530-5324 谭建明, 周永昌, 唐孝达主编. 组织配型技术与临床应用. 第1版. 北京:
6、人民卫生出版社, 2002. 621318 原始实验记录：每位同学需将实验课上记录的数据或现象附在报告后面。注意，“原始实验记录”是指包括实验中主要实验内容及其有关数据在内的原初记录，不只是测试数据的记录。以上1-4项为预习报告内容，需在上实验课之前完成；5-8项为上完实验课后完成的内容。在下一次实验课之前将1-8项完整的实验报告交班长再统一交给老师。二、预习要求：实验课前必须预习。实验报告中1-4项实验目的、实验原理、实验材料与试剂、实验方法为预习报告内容，首先要完全看懂实验讲义；其次要多查各种参考资料，包括理论教材、实验教程、期刊文献，在实验原理和实验方法中对相关的实验方法进行比较，对实验
7、原理进行分析，对实验讲义中的难点进行注释和讨论，充分体现学生对实验内容的理解。每节实验课上检查预习情况，计入成绩。三、实验小组划分：按学号分组：一般两人一组。四、实验上课时间 实验室安全守则在实验室内必须树立“安全为了实验，实验必须安全”的思想。化学实验经常会用到易燃、易爆溶剂，如甲醇、乙醇、乙醚等。有些溶剂还有毒性，如苯、氯仿等。有些有机酸、碱具有腐蚀性。这些物质都有可能给实验人员带来意外伤害，实验操作过程中必须树立安全第一的思想，绝不能马虎大意。一旦草率操作，发生事故，轻则损伤衣服、皮肤，重则着火爆炸，即影响人身安全又损坏公物，严重者还要追究责任。为避免发生事故，必须了解预防和处理事故的一
8、般常识。一、事故和预防1. 实验前必须细心检查玻璃仪器是否有裂缝、破损等，实验装置必须安全、稳当，严格遵守操作规程。2. 严禁在实验室内吸烟。易燃、易爆的有机溶剂必须远离火源、电源。多余的或实验用后的有机溶剂应倒入废物瓶或指定容器内，切勿倒入水池里。3. 严禁在实验室内吃食物。实验过程中会出现有毒或有腐蚀性气体的操作，应在通风橱内进行。4. 实验室必须穿实验服，以免酸碱腐蚀衣物。二、事故的处理与急救1. 火灾(1)一旦发生火灾，应保持沉静，不要惊慌失措，首先应立即熄灭火源，并转移附近的易燃物质。(2)小溶剂（即毫升）着火，可用湿布盖熄，稍大的火焰可用黄沙或湿拖把盖灭。有机溶剂着火绝对不能用水浇
9、，因为这样反而会使火焰蔓延开来。(3)若衣物着火，且勿奔跑，用厚的外衣包裹熄灭，较严重者应躺在地上滚动（以防火焰烧向头部），用自来水冲淋熄灭。(4)发生大火，应先用灭火器扑灭，不论何种灭火器，皆应自火的四周向中心扑灭。在尽力救火的同时向“119”报警。(5)严重受伤者应立即送医院治疗实验室常见灭火器如下：四氧化碳灭火器：用以扑灭电器内或电器附近之火。因CCl4本身有毒，且在高温下生成光气（剧毒），故不能在不通风的实验室内使用四氧化碳灭火器。二氧化碳灭火器：化学实验室常用灭火器，用以扑灭电器火灾，注意，由于使用的是压缩的CO2，液体不要喷在手掌上，以免温度骤降造成手部冻伤。泡沫灭火器：其内分别装
10、有NaHCO3溶液和硫酸铝溶液，使用时将同时颠倒，两种溶液反应生成NaHSO4、Al(OH)3及大量CO2，所以灭火机制仍然是CO2泡沫，因为后处理麻烦，故一般在大火时使用。2. 玻璃割伤玻璃割伤是实验室常见事故。如为一般轻伤，应用消毒过的镊子取出玻璃碎片，及时挤出污血，用蒸馏水洗涤伤口，涂上红药水和碘酒后包扎好。如为大伤口，应立即用绷带扎紧伤口上部，使伤口停止出血，立即送往医院救治。3. 烫伤切忌用自来水冲洗。轻伤涂甘油或硼酸凡士林，重伤应先涂烫伤膏，后立即送医院。4. 试剂灼伤(1)酸液或碱液灼伤皮肤时，若为酸液灼伤，首先用大量水冲洗伤处，再用5%碳酸氢钠溶液洗涤；若为碱液灼伤，首先用大量
11、水冲洗伤处，再用1%醋酸洗涤。最后再用水洗，涂上油膏凡士林。(2)碱液或酸液溅入眼睛时，抹去溅在眼睛外面的酸液或碱液，立即使用喷淋器用大量水冲洗。快速送往医院治疗，不允许用其他试剂进行中和。(3)酸液或碱液洒在衣服上，先用水冲洗。若为酸液再用氨水洗。若是碱液，再用10% 醋酸溶液洗涤，然后用氢氧化铵中和多余的醋酸，最后用水洗涤。(4)酸液洒在地上，先撒石灰粉，再用水冲洗。 5. 中毒如有毒物质进入口中，首先应用大量清水漱口。饮用大量清水后，用手指深入咽喉处，人为促使呕吐（若是腐蚀剂中毒则不能用此法，可服用牛奶、蛋清或植物油等），然后立即送医院治疗。若吸入有毒气体，应立即到室外呼吸新鲜空气，必要
12、时送医院治疗。6. 触电遇到触电发生，首先要拉开电闸以切断电源，并尽快用绝缘物（干燥木棒、竹竿、有机玻璃、橡胶棒、塑料棒等）将触电者与电源隔离，必要时进行人工呼吸，并报“120”迅速送医院救治。事故发生不仅会导致实验失败，而且会造成公共财物的损坏和实验人员身体的损伤。在实验室和工作过程中，要时时处处小心，只有严格按照操作流程进行操作，并保持实验秩序良好，才能消除事故隐患，防患于未然！目 录生物化学实验1实验一 糖和蛋白质的理化性质检验1实验二 酵母RNA提取与含量测定13实验三 果蔬中维生素C的定量测定（紫外法）18实验四 植物叶片过氧化脂质的提取与测定21实验五 蛋白质的定量测定(考马斯亮蓝
13、法)24实验六 蛋白质的定量测定（凯氏定氮法）26实验七 淀粉酶动力学分析（）30实验八 淀粉酶动力学分析（）40生物化学实验48实验一 酶联免疫吸附试验48实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量51实验三 CM-纤维素离子交换层析柱法分离卵清蛋白组分56实验四 枯草杆菌蛋白酶活测定59实验五 氨基酸的纸层析63教材、参考书66生物化学实验实验一 糖和蛋白质的理化性质检验（4学时）第一部分 蛋白质的理化性质第一节 蛋白质的颜色反应一、实验目的 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。 二、实验原理 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全
14、相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 三、实验器材与试剂 实验器材 1. 鸡蛋1个2. 吸管1.0mL（1）3. 试管 .5cm15cm（2）4. 试管架5. 试管夹2个6. PH试纸（5-7）7. 水浴锅实验试剂 1.卵清蛋白液：将鸡（鸭）蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，离心，上清液冷藏备用。2.1%茚三酮溶液： 1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。3.浓硝酸： 比重1.42。 4.10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100m
15、L。 四、实验方法 A. 黄色反应 蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物（苯及苯丙氨酸较难硝化，需用浓硫酸促进之。反应如下：操作方法：于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸5滴，加热，冷却后再加10NaOH溶液20滴，观察颜色变化。 B. 茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色。操作方法：取1mL蛋白质溶液置于试管中，加3-5滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。注意：此反应必须在pH57进行。C.双缩脲反应（参考实验） 将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分
