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1、8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化发布时间：2011年03月07日点击次数：次8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动子的不
2、同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如PL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个Hi
3、s 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+Fe2+Zn2+Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和 Qiagen 公司提供的pQE 系列。除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his
4、标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare（原Amersham）提供。8.1.2宿主菌的选择重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBle等recA和endA型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的
5、特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主：BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，PL，cspA等作为启动子的载体。BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lacV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如
6、：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和gor双突变。拥有trxB和gor突变的菌株比单具，trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。Rosetta 系列：是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有tRNA 水平，可以提高一些真核基因表达效率（更多信息可参考相应公司的资料）。BL21-Codon Plus系列：包括BL21-CodonPlus （DE3）-RIPL，BL21-CodonPls-RIL，BL21-CodonPls（DE3）-RIL, BL21-C
7、odonPls-RP，BL21- CodonPlus （DE3）-RP等。这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R），亮氨酸（L），异亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA 基因，更多用于表达一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT 含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene 公司资料）。M15/SG13009：自身表达T5 RNA polymerase，主要用于pQE系列载体的表达。另一个需要考虑的是大肠杆菌的密码子及其偏爱性。表1 大肠杆菌密码子使用频率统计TAAFRQCAAFRQAAAFRQGAAFRQTTTTF19.7TCTS5.7T
8、ATY16.8TGTC5.9TTCF15TCCS5.5TACY14.6TGCC8TTAL15.2TCAS7.8TAAstop1.8TGAstop1TTGL11.9TCGS8TAGstop0TGGW10.7CCTTL12CCTP8.4CATH15.8CGTR21.1CTCL11CCCP6.4CACH13.1CGCR26CTAL5.3CCAP6.6CAAQ12.1CGAR4.3CTGL46.9CCGP26.7CAGQ27.7CGGR4.1AATTI30.5ACTT8AATN21.9AGTS7.2ATCI30.6ACCT22.8AACN24.4AGCS16.6ATAI30.7ACAT6.4AAAK3
9、3.2AGAR1.4ATGM30.8ACGT11.5AAGK12.1AGGR1.6GGTTV16.8GCTA10.7GATD37.9GGTG21.3GTCV16.9GCCA31.6GACD20.5GGCG33.4GTAV16.1GCAA21.1GAAE43.7GGAG9.2GTGV16.11GCGA38.5GAGE18.4GGGG8.68.2表达条件的建立为了方便后续的纯化操作, 保持目标蛋白的活性,提高蛋白的得率，我们在进行蛋白的大量制备之前应该首先确定目标蛋白的最佳表达条件。首先，保证表达蛋白稳定，尽量避免蛋白酶的降解，我们可以通过使用一些蛋白酶缺陷性的表达宿主，其次在表达的过程中可以在培
10、养体系中添加一些蛋白酶抑制剂等来解决。与实现外源蛋白的稳定表达相比，更多时候保证目标蛋白的可溶性表达，是建立表达条件的主要工作。很多外源基因在大肠杆菌表达时很容易形成不可容的包涵体，其原因可能有：表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体；蛋白合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。目前对包涵体的形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚, 但已经报道了很多用于优化表达以增加目标蛋白可溶性的方法。8.2.1确定表达状况转化构建好的质粒至表达宿主感受细胞，挑取单克隆子至5ml 含有相应抗性的
11、LB 培养基中，37，200 rpm，培养至OD600=0.5左右，加入IPTG至终浓度0.2mM，转移至28，200 rpm 继续诱导培养，可以在2h，4h，6h分别取样以分析表达状况。将取出的1ml 菌液12000 rpm 离心1min，收集菌体，加入1ml PBS 缓冲液重悬沉淀，同样离心1min。再加入300500ml PBS重悬细胞。超声破碎细胞（具体见操作细胞破碎）将破碎液体4，12000 rpm 离心10min，分离上清和沉淀。SDS-PAGE 分析上清和沉淀的蛋白分布（具体操作参考SDS-PAGE）。若在上清中有明显的目的蛋白的条带，即可以放大培养进而纯化目标蛋白。若目标蛋白的
12、表达主要分布于沉淀，则可以尝试一下几种方法来改善表达。改变表达载体下手，像GST，NS，MBP, TrxA等融合标签能够提高很多蛋白在大肠杆菌中表达的可溶性，此外一些分泌标签如ompA,Pet-22b上的pelB也能够将目标蛋白运输至细胞的周质空间，从而提高目标蛋白的可溶性。降低表达速度，可采取低温诱导，如15诱导过夜，或者采用弱启动子表达载体。尝试一些特殊设计的表达宿主Origami：thioredoxin redctase/gltathione redctase 双突变适合带thioredoxin redctase的融合表达载体，帮助形成更多的二硫键。对于一些蛋白可能无法实现可溶性表达，这
13、时候溶解包涵体后再纯化是唯一的解决办法。8.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）大肠杆菌表达纯化外源蛋白，SDS-PAGE是必不可少的操作。可以用来检测蛋白的表达情况(表达量，表达分布等)，用来分析纯化的目的蛋白的纯度。本小节列出SDS-PAGE 操作中一些试剂的配置及其基本的操作过程。8.2.2.1主要试剂的配置（1）30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4保存。丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应
14、谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。建议实验室划出专门的台面，设置单独的配置器皿进行SDS-PAGE 的相关实验。（2）1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液。（3）10% SDS溶液：SDS 10.0g 加入ddH2O ToTo100。（4）10%过硫酸铵：新鲜配制。（5）TEMED溶液：4保存。（6）1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液。（7）2样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液。（8）5Tris-甘氨酸电极缓冲液： 15.1g Tris，94g甘氨酸和5g SDS定容到1000ml（建议每次电泳用新稀释的缓冲液）。（9）考马斯亮蓝R染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:9:2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R，搅拌溶解。（10）脱色液：10%冰醋酸（可加如乙醇，建议不要使用甲醇）。8.2.2.2主要操作步骤1、凝胶制备（1）安装洗涤干净的玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中。（2）配制10%的分离胶（具体参考表2）：迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层异丙醇或水。（3）在分离胶聚合的过程（可
