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1、实验报告 题目:单元一:目的基因的获取 指导老师:谭红铭 张添元 日期:2013/10/17一实验目的：(1) 掌握总RNA的提取方法和技术(2) 了解总RNA的提取要注意的问题(3) 了解用RT-PCR法获取功能基因的原理(4) 学习和掌握RT-PCR的技术方法二实验原理：(1) RNA提取：RNA在细胞中是与蛋白质结合在一起的。提取RNA时需先用强变性剂使蛋白质和DNA变性，同时抑制核糖核酸酶(RNase)的活性，然后通过有机溶剂如氯仿分层抽提去掉蛋白质和多糖等，最后通过RNA沉淀剂如异丙醇的帮助下沉淀分离RNA。(2) RT-PCR：总RNA中的mRNA体外在反转录酶的作用下可合成与mR
2、NA互补的单链DNA，称为互补DNA（cDNA），再在DNA聚合酶的作用下，以cDNA第一链为模板，以四种脱氧核苷酸（dNTP）为材料，在引物的引导下，合成大量双链DNA。三实验材料： 斑马鱼、Trizol Reagent（Invitrogen）、DEPC处理的超纯水（0.02-0.1%）、氯仿、异丙醇、无水乙醇、高速离心机、各种规格的RNase Free的枪头、EP管（1.5ml）、RNase Free的烧杯及量筒玻璃棒等、新开的大滤纸、碎冰及泡沫冰盒四 实验准备： 由于实验过程中实验者手、臂上的细菌和真菌，人体自身分泌的RNase如手汗和唾液会带入试管或污染用具，使RNA降解，因而实验一开
3、始就必须自始至终佩带口罩及乳胶手套，并经常更换。五 实验步骤、现象、结果及分析：总RNA提取：取斑马鱼一条，用滤纸吸干水，至于电子秤平内称重，为0.293g，后置于研钵，用大勺子往其中加入液氮，待其冷冻后，开始研磨，使其始终保持粉末状，由于液氮挥发，需补充液氮，直至彻底研磨至面粉状细末为止。在研钵内粗略将粉末分成三份，每份约80mg，再用液氮冷却过的小不锈钢勺子挑取其中一份加入预先装有1mlTrizol试剂的管中，剧烈震荡使之分散均匀，分装三份，标号1、2、3，本实验中由于存在小块凝结，因而使用移液枪吹打使之分散均匀。室温静置5min，待其反应完全，让Trizol充分作用，使核蛋白质解聚；加入
4、200l氯仿，剧烈震荡15sec，室温静置5min，可看到试管内分两层，上层透明水相层为RNA层，下层红色有机相为DNA和蛋白质层；使用高速离心机在12,000g，离心15min，使分层彻底；小心吸取上层水相（含RNA）约500-600l转移入另一干净离心管，使用200l和100l枪头转移，宁少勿多，切勿吸到中间层。加入500l异丙醇(沉淀RNA)，轻柔颠倒多次混匀，室温静置10min；再次使用高速离心机在12,000g，离心15min；取出试管后发现底部出现白色沉淀，小心用移液枪吸取上层废液，并用枪头吸干，加入500l75%乙醇(需用RNase Free水配制)洗涤沉淀，轻柔颠倒几次；使用高
5、速离心机在7,500g，离心5min；小心用移液枪吸取上层废液，并用枪头吸干，在实验桌面垫上干净滤纸，将试管管口打开，平卧其上，另一滤纸盖在其上，室温下干燥，从一侧观察试管底部白色沉淀，待其刚好消失(透明)为止；加入30lddH2O(RNase Free水)溶解，置冰上保存备用。鉴定RNA纯度、浓度： 取3l总RNA样品，直接加在检测仪的加样板其中一个孔上，吸头不能碰到加样板，以RNase Free水为空白对照，测定浓度及A260/A280。表一：吸光度测定组别A260A280A260/A280浓度(ng/l)12.5511.3801.8492040.93323.6782.0311.81129
6、42.24632.5101.2611.9902007.803 由于260nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸和蛋白等有机物的值，当A260/A280的比值介于1.8-2.0时，我们认为RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的。本实验三组比值均介于该范围内，证明所提RNA纯度较高。鉴定RNA完整性:RNA电泳检测：(1) 制备琼脂糖凝胶:称取琼脂糖1g，加入1TAE缓冲液液中，带水合数分钟后，置微波炉中高火1min将琼脂糖融化均匀，加热时盖上封口膜以减少水分蒸发。(2) 将样品槽梳子插进托盘长边上的凹槽内(距一端约1.5cm)，梳齿底边与托盘表面保持0.5-1mm的间隙。(3) 待凝胶溶
7、液冷却至50左右时，轻轻倒入电泳制胶版上，除掉气泡。(4) 凝胶冷却凝固后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，使其液面刚高出琼脂糖凝胶。(5) 桌面铺一层薄膜，取RNA样品1l，加RNase Free水3l，SYBR Gold燃料1l，6Loading Buffer1l，用枪头吹打混匀，后吸取加放凝胶点样孔中，点样孔靠近电源负极(黑色)一端，用120v电压电泳。(6) 电泳完毕，取出凝胶，在波长为254nm的紫外灯下观察染色后的电泳胶板，于凝胶成像系统中拍照并保存之，电泳照片如下图一所示： 1 2 328srRNA18srRNA图一：总RNA电泳示意图 由上图可以看出，2号组亮度较
8、1、3组高，因其RNA浓度最大。2号组28s和18s条带明亮、清晰，并且28s的亮度在18s的两倍以上，证明RNA的完整性较好。1号组和3号组不太清晰，但28s的亮度约在18s的两倍以上。逆转录PCR：(1) 反转录反应： 取事先按下表二实配量配制的反应液120l混匀后分装PCR管，每管9l，并加入各组别RNA样品1l，放入PCR仪中，进行反转录反应。表二：反转录反应体系每管/组(l)实配(l)10RT Buffer112MgCl2224dNTP Mixture(各10pmol/l)112RNase Inhibitor0.253AMV Reverse Transciptase0.56Oligo
9、 dT-Adaptor Primer(2.5pmol/l)0.56RNase Free H2O 3.7546RNA Sample(500ng total RNA)1Total10120(2) PCR扩增目的基因： 取事先按下表三实配量配制的反应液600l混匀，往完成反转录反应的试管中每管加入40l，再放入PCR仪中，进行PCR扩增反应。表三：PCR反应体系每管/组(l)实配(l)5PCR Buffer10120上游特异引物(10pmol/l)112下游特异引物(10pmol/l)112灭菌蒸馏水27.75333Taq酶0.253cDNA一链(反转录产物)10Total50600 PCR反应条件
10、如下: step1 94变性 2 min step2 94变性 40 sec step3 60复性 40 sec step4 72延伸 40 sec step5 72温育 5 min step6 4 保存 step2-4运行30个循环。电泳检测扩增产物： 反应结束后，往每管PCR产物中加入6Loading Buffer10l，混匀，后每管取出3l点在桌面薄膜上，同样marker组也取样3l，然后各加入SYBR Gold1l，用枪头吹打混匀，后吸取加放凝胶点样孔中，点样孔靠近电源负极(黑色)一端，用120v电压电泳。电泳完毕后，取出凝胶，在波长为254nm的紫外灯下观察染色后的电泳胶板，于凝胶成
11、像系统中拍照并保存之，电泳照片如下图二所示： M 1 2 3500bp M：DNA marker 1、2、3：mRNA的RT-PCR产物图二：RT-PCR琼脂糖凝胶电泳示意图 由上图可以看出扩增产物很明显，三组条带均于同一处显示出亮条纹，与marker亮条纹所处位置一致，证明目的基因扩增正常。剩下的PCR产物统一置于-20冰箱保存。六 实验报告要求与思考题(1) 计算所提取的总RNA的A260/A280值以及浓度。 见表一(2) 写出3种常用的RNA酶的抑制剂及其作用机理。答：1.异硫氰酸胍，对RNA酶有强烈的变性作用;2.焦炭酸二乙酯(DEPC)，通过与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而
12、抑制酶活性；3.RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin），是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶紧密结合形成复合物从而使其失活。(3) 附上RNA电泳结果的图片并进行正确的标注。 见图一(4) 琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响。答：1.DNA分子构象，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动得最慢；2.DNA分子大小，分子越大，所受阻力越大，移动越慢；3.电源电压，4.离子强度等。(5) 如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因。答：1.误用蒸馏水配置凝胶；2.电源接触不良；3.凝胶样品中存在气泡；4.待分离的DNA大于琼脂糖所能分离的DNA分子的有效范围，无法抛出点样孔。(6) RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。 见图二(7) 如何提高RT-PCR的灵敏度和特异性。答：（1）提高灵敏度：使用一步法进行RT-PCR，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染，得到更高的灵敏度。 （2）提高特异性：使用Oligo dT或基因特异性引物均较随机引物有更高的特异性。
