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1、miRNA常用实验方法一、miRNA的检测方法miRNA的 realtime-PCR 检测方法1、realtime-PCR 引物设计miRNA realtime-PCR引物设计方法：1） stem-loop RT引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的miRNA序列修改最末端 6 个碱基即可。通用茎环结构序列为： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如设计miR-1 （ UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAT引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3末端的6个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA
2、GGTATTCGCACTGGACACGAC2） realtime 上游引物设计：miRNA序列除去3端6个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1的上游引物为（注意把 U改为T） : TGGAATGTAAAGAAG查引物的 Tm值（一般参考DNAMA）如果Tm值较低，则在5端加GC使 Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT4 度。3）下游引物是通用的，序列为 GTGCAGGGTCCGAGGT4）弓|物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性；同时最好将 PCR产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小
3、，需要3姬上的琼脂糖胶）。2、miRNA反 转录miRNA的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。我们一般使用的是 TIANGEN的 MLV逆转录体系为：RNA500ng2ug5xbuffer2uldNTP0.25ulDDT0.25ulRRI0.25ulMLV0.25ulRT primer 0.5ulH2O（RNase free） 补至 10ul程序为（PCR仪中通常命名为 CTFRT 16度，30min; 42度，60min ; 85度，5min ;4度，hold。! !做miRNA的反转录时，注意不要忘记内参的RT,即一个样品至少要做目的miRNA和
4、内参两管反转录反应。3、realtime-PCR 实验miRNA逆转录完成后得到的 cDNA即可进行下一步 PCR在确认引物的特异性后， 我们可以进行正式实验。一般每个样品至少需要 3个平行孔。Realtime PCR体系为（ABI定量PCR仪需要加ROX dye II , Biorad 定量PCR仪不需要加 ROX：（Biorad 不加）2X SYBR 10 ulROX II 0.4ulPrimer 1ulTemplate 1ulH207.6ul（Biorad 8ul ）需要注意的几点：1）在配制PCR体系时，请一定配制总体系，逐步分装。每步分装前充分 混匀。这一点是PCR平行性的保证。2）
5、配制体系尽量在冰上进行。3）请选用比较准确的枪进行体系配制，并注意体系的冗余。一般来说，配制一整个96孔板的PCR体系，我会配制100个反应的总量，保证分装到最后稍有剩余。PCR程序：95度，1min； 95度，5s； 60度，34s （此步在读取荧光值）。40到45个循环。4、realtime PCR 结果分析realtime PCR反应结束后返回 Ct值，可以利用定量 PCF仪软件自带的程序进行分析，也可 以利用EXCEL表格进行相对定量计算。具体的计算方法：将三个平行孔的数值拷入到EXCEL表格的相应位置，即可自动计算出相对值。注意，第一组样品的值将被默认为归一为1。其他的样品与之相比得
6、出相对值。EXCEL表格公式见附件。二、miRNA靶基因的预测miRNA靶基因预测软件简介1、TargetScan : http:/www.targetscan.org/首先选择预测的物种，如果要预测小鼠的miRNA和靶基因，则点击右上角的“Go toTargetScanMouse ”。第二个选项可输入基因名 （有时不识别别名），点击submit即可，此操 作可预测可能靶向该靶基因的 miRNA或者输入miRNA的名字，点击submit，此操作可以预 测该miRNA的靶基因。f l-. l IlJ KI. d *11 L iCiCiL-t FbC -r_T Til?旧 M i M Z.i 唯僵
7、轧p T* JJ WRt M12、 Pictar : http:/pictar.bio.nyu.edu/凸叱耳片审住岳i!Ul输入网址后进入pictar主页，下面有几个可选用的数据库，一般选用最后两个数据库即可。 点击进入预测界面。选择物种，选择要预测的miRNA（注意：如果你感兴趣的miRNA在下拉菜单中未列出，则不可预测，可考虑换用其他软件）并点击search for targets of a miRNA或输入gene ID （注意：与targetscan 不同，pictar 一般不识别基因名，最好输入gene号：NM_* ）点击 search for all miRNAs predict
8、ed to target a gene.进行预测。3、Mirbasehttp:/www.ebi.ac.uk/e nright-srv/microcosm/cgi-bi n/targets/v5/search.pl分别输入miRNA名或基因名即可进行预测。其他选项不用更改。预测结果的处理和分析我们通常会将三种不同软件的分析结果做比较，选取两种以上软件预测的交集部分作为我们候选的靶基因。如果这样的结果仍然过多，可以选取三种软件预测的交集进行下一步筛选。如果三种软件预测的结果没有交集部分，可以取并集，然后从中按功能提示进行挑选。三、miRNA的过表达和敲低1、过表达过表达miRNA 般可采用两种方法
9、：a构建过表达载体；b人工合成成熟miRNAa构建过表达载体1) 获取 miRNA基因的序列及旁侧序列进入 Ensembl( http:/www.ensembl.org/index.html)主页。/IG enIntcriiEt JplTcrFf电pojt.lgCL：JS*诗座7心2刖 3ruBfi.ir-1 ffiht立*E oafli)歹看婆 收nu Q iflO tiaiiiDJ，Fh蠡高车釦肝谒*】ft臥斡宣*：-5in- W Hi * FT5?arch. Mcuae呼 伯mrnii-niir- l -1|e g human geire BR匚竝 ” rat X:lOOOCO.2OOC
10、DD or intulinNtow tc Enitmbil?阳艸! kngw yw tinBrow* J Gt Mm 帀心 EnQonib prccc prcducas qb口mo * JWbdGQR fa xwt川畝尋e jndi Eh硏ukaryo( 石p%io石 and rrike? this infnriBitjon fresly agi Bbls animeClkk qn 9 lin blqw to gg Ic IH* 和時gq鬲 hgme pagnpgpulnr gtHncum*! iggj2 mn:荀记业忙HumanjWoxjjfl?. 1_9迫盯1 Filler“ i略& 厂l
11、RTlll 师th our xleo tiunnisla aridr? Mdl 1 tC ytMjf音麻峙咅Rl耳rf- 兔酎讣 for b UW/iL or pirotM lizhg BLAIS T gr BLAT用.匚Eliztl iMlihil! llhE J占yiQlJ 的d frEm sur pubnc datafiase L!c?QUir JdUabdHPfi JHin FA5TA F/ySQL and DthJr7詁I林e Eseinbl畀hh昌由制目,输入 miRNA名，点击进入。在 export data页面上选择输入5 flanking sequenee3 flanking
12、sequenee分别为200bp（见下图），然后点击next即可得到包括前体和左右侧翼200bp的序列。2）基于这段序列，我们可以设计该 miRNA的表达序列。引物设计原则：扩增产物包括前体， 并左右各有至少 70bp的侧翼序列，长度一般在200bp-500bp。其他同一般引物设计。载体可以选用任意使用 RNApolll识别的启动子的载体，包括T7, CMV等。常用的是peDNA3.1，不要带标签的。注意：如果miRNA位于cluster中，则扩增长度要控制，避免同时包括两个或两个以上的 miRNA完成表达载体的克隆并测序确认后，转入到细胞中进行表达检测。如 果目的miRNA的表达明确，则载体
13、构建完成。b合成成熟的miRNA序列 查出miRNA勺准确序列，请公司合成成熟的序列。常用的公司有: 上海吉凯；in vitroge n等。2、敲低目前做内源性 miRNA的敲低一般使用人工合成的 miRNA的反义链，即成熟miRNA的序列的反 义互补序列。女口 mir-x 序列为 UCACACAACCCACCACCAU则G其inhibitor 序列为 CAAUGGUGGUGGGUUGUG将该序列送交公司合成即可。报告基因实验方法一、miRNA靶基因筛选荧光素酶报告基因实验1荧光素酶报告基因质粒的构建载体质粒为经过改造的pcDNA3.1,其图谱见下图。可用的酶切位点为 Notl ,Xhol及X
14、bal.推荐优先使用XhoI和XbaI两个酶切位点。如过不能用，可用Notl.EcoRINot IXholXbalflue3 UTR of Targets一Ed一一一一 mqx一 QJZX二 ON一 X2 AtroQ山 -(rooUJ一 X&9-HEEm一 3一 8LZQSN 三P.S工-怎 一 eEd 一 MN靶基因3 UTR的获得。3 UTR序列是指从Mrnaz终止密码子后的第一个碱基开始到mRNA最后一个碱基（通常是 polyA结尾）。模板可采用相应物种的 cDNA或基因组。在选择模 板时要注意：一般来讲，cDNA适于所有的3 UTR扩增，但有时3端AT过多导致引物 设计困难时，可以考虑用基因组做模板。但是基因组做模板的前提是靶基因3 UTR由一个外显子组成。相关信息可以从ensembl中查阅外显子信息可以知道。一般尽可能全面的扩增3 UTR但如果3 UTR过长或引物设计困难，可以选取包括miRNA结合位点的一段3 UTR引物设计的原则同一般引物设计。2、荧光素酶实验构建好荧光素酶报告基因实验后， 准备开始做报告基因实验前， 你还需要准备以下材料：1） TK质粒，作为共转染的内参。 2）miRNA的过表达质粒或合成的 miRN
