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1、核酸的分离与纯化A核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、 多糖、脂肪等生物大分子分开。A在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结 构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的 纯度。A核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大分子 的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的浓缩、保存等几个主要步骤。A每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。一、材料的选择A临床常见的标本血液、组织及体外培养的细胞等都可作为提取核酸的原料，具体实验材 料的选择应根据实验的目的来确定
2、。二、核酸的释放（一）机械法 包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机 械力使细胞破碎，但机械力也可引起高分子量线性分子的断裂，因而不适用于染色体DNA 的分离纯化。（二）化学法A在一定的pH环境下，加入表面活性剂或强离子剂使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀，核 酸被从细胞内释放出来。向缓冲液中加入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性，保护核酸 不被降解。（三）酶法A通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核 酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。A溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的0-1,4键 水
3、解。蛋白酶K能催化水解多种肽键，且在65C及有EDTA、尿素和去垢剂如0.5%SDS或 1%Triton X-100 存在时仍保留有酶活性，对于高分子量核酸的提取有很大的优势。三、核酸的分离与纯化（一）核酸分离纯化的基本方法1. 酚抽提法细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液，混匀后离心分 离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中加入醋酸 钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核酸可以用 70%乙 醇洗涤以除去多余的盐分，即可获得一定纯度的核酸。2. 层析法包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。因分离和纯化同
4、步进行，并且有商品试剂盒供 应而被广泛应用于核酸的纯化。在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶 或玻璃表面而与其他生物分子分离。3. 密度梯度离心法双链DNA、单链DNA、RNA和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心的方法形 成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备。A氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法是纯化大量质粒DNA的首选方法。A氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质，梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后 形成的核酸区带经紫外灯照射产生荧光而被检测。用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇 沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。（二）基因组DNA的分离纯化1.生物体组织细胞
5、2酚抽提法玻棒缠绕法3.基因组DNA粗品4.PFGE分离5.特定的DNA片 段6.AGE分离PAGE分离7.乙醇沉淀洗涤8.基因组DNA纯品9.精分离10.粗分离11.前处理 12.有机溶剂抽提离子交换层析纯化13.细胞裂解14.蛋白质变性沉淀降解15.DNA释放16.甲 酰胺解聚法哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线1. 酚抽提法A以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用 pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理, 获得所需的DNA样品。一、酚抽提法主要试剂的作用：EDTA：A二价金属螯合剂，抑制
6、核酸酶；A降低细胞膜的稳定性SDS 的作用：A溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；A溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；A对RNA、DNA酶有抑制作用；A与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。蛋白酶 K：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有 更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用。A酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。A PH 8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。A在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相， 保持分相的稳定性。为什么苯酚要
7、重蒸饱和后才能用于DNA的分离？苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸 二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱 和酚，并调节至中性。另外使用饱和酚减少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。2. 甲酰胺解聚法A细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂 解 DNA 与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有 机溶剂。3. 玻棒缠绕法A以盐酸胍裂解细胞,制备的DNA分子量只有大约80kb,其长度不适用于构建基因组DNA 文库，但用于Sou
8、thern杂交和PCR反应都可以获得很好的结果。A该法简单快速，可同时提取多个样品。4异丙醇沉淀法A通过SDS和蛋白酶K消化与DNA结合的蛋白质，并失活DNA酶，酚氯仿抽提去除蛋 白质后，用2倍容积的异丙醇来沉淀含0.1mol/L NaCl的DNA溶液，DNA沉淀是丝状，而 RNA在异丙醇溶液中仍为可溶状态,利用这一物理特性从DNA中去除RNA,省去了加RNA 酶消化RNA的步骤。(三) 质粒 DNA 的分离纯化质粒A质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子。A其大小范围从lkb至200kb以上不等，已经在形形色色的细菌类群中发现质粒，这些质 粒都是独立于细菌染色体之外进行复制和
9、遗传的辅助性遗传单位。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程 中具有极广泛的应用价值，因而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术。选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素：1菌株类型2质粒的大小3细菌染色体DNA变性条件强弱的控制4细菌的培养与收 集1. 碱裂解法A在NaOH提供的高pH (12.012.6)条件下，用SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH 共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出共价闭环的质粒DNA。A细胞裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，这些复合物在 高钾盐条件下，可有效沉淀，而质粒DN
10、A保留于上清中。通过无水乙醇沉淀质粒DNA， 并用70%的乙醇洗涤，获得的DNA纯度可满足测序与PCR等实验的要求。2. 煮沸裂解法A是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁 后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏 DNA 链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体 DNA变性，但共价闭环质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，共价闭环质粒DNA 可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的 质粒 DNA。A适用于小质粒DNA (V15kb)的制备。3. SDS 裂解法A是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中
11、，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再 用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提。A该法有利于大质粒DNA (15kb)的提取。4. 小量一步提取法A直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完成细胞裂解与蛋白质变性两个过程，然后离心 去除大部分胞核DNA与蛋白质，最后从上清中回收质粒DNA。A该法简单快速、经济可行，可用于内切酶图谱分析。5. 质粒 DNA 的纯化( 1)聚乙二醇沉淀法A质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA,并用RNase消化小分子RNA；然后 在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用酚/氯仿抽 提
12、，乙醇沉淀。( 2)柱层析法A柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。A树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交 换与吸附的相互作用进行纯化。A以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可 逆性结合来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附到硅基质上，以50%的乙醇溶液 洗去RNA和糖类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA分子重新水合，并通过离 心洗脱出来。(3) CsCl-EB 法A是一种沉降平衡离心法。经超速离心，离心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB 存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后
13、得以分开。其中蛋白质密度小( 1.3 g/cm31.4g/cm3),浮于液面；RNA密度大(2.0g/cm3),沉于管底；各种DNA密度介于蛋 白质与 RNA 之间，处于中部。五、质粒DNA的纯化A过量EB处理前，细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左 右，难以区分。经过量EB处理后，不同分子构型的DNA与EB的结合能力不一样，因而 密度下降不一致，可有效分离。A闭环质粒DNA为超螺旋三级结构,EB不易插入，结合量少，密度下降小，约为1.59 g/cm3。 A染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB,密度下 降较多， 约为 1.5
14、4 g/cm3。(四) DNA 片段的回收A无论采用何种方法从何种支持介质中回收DNA片段，都要注意两个原则，一是要提高 DNA片段的回收率；二是要去除回收DNA样品中的污染。A DNA的回收率与DNA片段的大小有一定关系，随着分子量的增大，回收率明显下降， 大于20kb时，回收率低于20%。A DNA片段的含量与回收率也有密切关系，量越少回收率越低，若DNA片段量小于500ng 时，几乎很难回收。因此回收DNA片段时，要正确选择回收方法，并要注意提高DNA上 样量，减少DNA回收时的洗脱体积以达到提高回收率的目的。1. 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段A主要包括二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素膜
15、插片电泳法、电泳洗脱法、冷冻挤压法及 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。(1) DEAE纤维素膜插片电泳法A DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以结合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素膜插 入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条带前，继续电泳直至所需回收的DNA片段刚好转移到 膜上。取出DEAE纤维素膜，低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出DNA分子。A该法操作比较简单，可同时回收多个DNA片段，对500bp5kb的DNA片段回收率好, 纯度高，能满足大多数实验的要求。A DNA片段大于5kb时，因结合力增大而回收率下降。至10kb或为单链DNA时，其与膜 的结合变得很牢固而难以回收。因此，本法不适合于分子量大于10kb的DNA片段的回收, 也不能回收单链DNA。(2) 电泳洗脱法A包括两个主要步骤，一是将待回收的DNA片段电泳出凝胶介质，使其进入一个便于回 收的小容积溶液中；二是分离纯化出DNA片段。A按是否使用透析袋可分为透析袋电泳洗脱法与非透析袋电泳洗脱法两大类。A透析袋电泳洗脱法需要切下含待回收DNA片段的凝胶条，然后放入透析袋内进行电泳, 使DNA分子迁移出凝胶条进入透析袋的溶液中，最后经抽提纯化回收DNA分子。A该法操作很不方便而且不适合于同时回收大量不同的DNA片段，但可有效回收从200bp 至大于50kb的DNA，尤其对大于5kb的DNA有良好的回收率
