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1、 普通遗传学 实验指导 PU TONG YI CHUAN XUE SHI YAN ZHI DAO郑茂波 编著哈 尔 滨 学 院前言 遗传与变异问题是生命科学研究的核心。随着其他相关学科的发展, 遗传学逐步实现从对生物个体的表现型描述向较为精密的实验科学的飞跃, 从而成为生命科学研究的前沿领域。遗传学与许多学科相结合形成许多交叉学科, 如遗传学与细胞学结合形成细胞遗传学；遗传学与生物化学相结合形成分子遗传学；遗传学与数学相结合形成数量遗传学；遗传学与物理学相结合形成辐射遗传学等, 反映在实验手段上比遗传学发展的早期更为多元化。20世纪50年代, DNA双螺旋模型的建立标志着分子遗传学的诞生, 是
2、生物学发展史上的里程碑。 普通遗传学实验是配合遗传学理论教学而设置的一门基础课程, 通过实验课的教学, 力求使同学们能够对遗传学的基本理论和概念有更加深刻的认识, 激发同学们对探索遗传学规律的浓厚兴趣。更为重要的是, 在实验过程中培养同学们观察问题、分析问题和解决问题的能力, 锻炼同学们实际操作能力。 哈尔滨学院遗传学教研室通过多年的教学实践, 在综合考虑到培养目标、学时设置、本门课程与其他课程教学内容重叠情况等因素的情况下, 选用了本书所包括的实验内容, 其中有经典遗传学实验、细胞遗传学实验、微生物遗传实验和分子遗传学实验。通过这些实验, 可以使同学们对遗传学的主要研究方法和手段有一概括的了
3、解, 并在实验课中得到一定的训练。初步具备进行遗传学研究的基本实验方法和手段。由于课程设置的变化, 现已经把原来遗传实验中有关质粒DNA的提取和分子杂交等实验内容列入到分子生物学实验教学之中, 因此, 请同学们在学习过程中注意参考有关课程的实验内容, 从而对遗传学的实验方法有较为全面的认识。教师可以根据课时安排和学生情况对实验内容作适当调整。 书中采用的图片除特殊说明外, 均为本实验室在遗传学研究和实验教学过程中所拍摄和制作的。许多教师和工作人员在教学实践中对实验内容和教学方法提出过许多宝贵的意见和建议, 使得遗传学实验的教学得到不断完善。学院多届同学参与了大部分实验内容的操作和改革, 并编写
4、和提供了部分实验素材, 对此我们深表谢意! 由于时间仓促以及我们的水平有限, 教材之中可能会有不妥之处, 希望各位同仁给予批评指导, 我们将不胜感激。 作 者 2010 年9 月于哈尔滨目录实验1 植物染色体标本制备1 实验2 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备和观察4 实验3 孚尔根核反应染色法6 实验4 减数分裂与配子形成11实验5 果蝇的培养与性状观察29实验6 果蝇唾腺染色体的制备和观察32 实验7 果蝇杂交实验36 实验8 高等植物有性杂交39 实验9 四分子遗传分析：粗糙链孢霉的分离和交换43 实验10 染色体组型分析47 实验11 去壁低渗法制备植物染色体标本52 实验12 人类染色体
5、分析：外周血培养及制备染色体标本59 实验13 植物染色体分带技术66 实验14 姐妹染色单体差别染色69 实验15 植物多倍体诱导及其细胞学鉴定85 实验16 性染色质：人体X染色质观察 90 实验17 细胞微核（micronucleus）检测技术96 实验18 植物总DNA的提取 100 实验19 细菌基因组DNA的提取106 实验20 质粒的提取109 实验21 细菌的转化实验90 实验22 细菌转导96 实验23 基因突变分析与检测100 实验24 荧光原位杂交实验 106 实验25 数量性状的遗传分析109 实验26 遗传平衡定律 113 附录1 实验室常用试剂的配制 116 附录2
6、 不同的值及自由度时的P值表 119 实验一 植物染色体标本制备一、实验目的 1、学习植物根尖压片标本制备方法的基本技术。2、熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体形态和结构上的动态变化，并学会染色体简易永久片的制片技术。二、实验原理 有丝分裂是高等动植物体细胞分裂的主要方式，高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点、幼叶等部位的分生组织。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。在有丝分裂过程中，真核细胞的染色质凝集成染色体，每个染色体能复制一份，复制的姐妹染色单体在纺锤丝的牵拉下分向两极，精确地平均分配到两个子细胞中去，从而使产生得
7、两个子细胞及与其母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。由于染色体上有遗传物质DNA，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。染色体的这种特异性、恒定性、连续性和在细胞分裂过程中的正确复制及分配被确认为是遗传物质的载体，是遗传传递规律的细胞学基础。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。三、实验材料 洋葱（Aillum cepa）根尖，蚕豆（Vicia faba）根尖 。四、实验器具和药品试剂显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片；Carnoy固定液、改良苯酚品红染色液、0.002M 8-羟基喹啉水溶液、0.050.2% 秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶
8、液、1M HCl、加拿大树胶。五、实验方法和步骤（一）材料准备 1、培养洋葱根尖 选取底盘大的洋葱做生根材料，剥去外层老皮，用刀削去老根，注意不要削掉四周的根芽，将洋葱的鳞基置于盛水的小烧杯（或广口瓶）上，让洋葱的底部接触杯内的水面。把小烧杯放进2025培养箱内培养。培养时注意每天换水12次，防止烂根。待根长约1.5 cm时，在上午九时取健壮的根尖进行预处理。 2、种子培养根尖 选取蚕豆（或小麦、玉米等）种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进2025培养箱内培养。当根尖长11.5cm 时，即可以在上午九时取生长旺盛的根尖进行预处理。 （二
9、）预处理 目的，使获得中期分裂相较多的细胞，使染色体缩短，分散，形态结构稳定，便于压片，有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数。 预处理机理：阻止或破坏纺纺锤体微管的形成，使有丝分裂过程被抑制在分裂中期阶段，以便累积较多的处于分裂中期的分裂相；改变细胞质的粘度；导致染色体高度浓缩、变短，利于染色体的分散。在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。一般是在分裂高峰前处理1.5小时以上。处理的方法如下： 1秋水仙素水溶液 常用浓度为0.050.2%，室温下处理34小时。对抑制纺锤体活动的效果明显，易于获得较多的中期分裂相，并且染色体收缩较直，有利于对
10、染色体结构的研究。 2对二氯苯饱和水溶液 室温下处理35小时，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，对染色体小而多的植物中，计数染色体制片效果最好。 38-羟基喹啉水溶液 使用浓度为0.0020.004M，一般认为它将引起细胞粘滞度的改变，进而导致纺锤体活动受阻。通常处理24小时，可使中期染色体在赤道面上保持其相应的排列位置，另一优点是处理后的缢痕区较为清晰。 4低温处理 将材料如小麦，浸入蒸馏水内，放置到14冰箱中（玉米及水稻68）处理2024小时，也起到良好的效果。 （三）固定 通常采用的是Carnoy固定液。固定的目的是用化学的方法把细胞迅速杀死，使蛋白质变性，并尽量保持原来的分裂状态
11、，同时更易于着色。固定时，将根尖投入固定液中室温处理324小时。材料若不及时用，可经过90%酒精和70%酒精浸洗一次，再换入新的70%酒精中，置于冰箱内04保存备用。经过较长时间保存的材料，在进行观察前可用固定液再处理一次，效果较好。 （四）解离 目的是使分生组织细胞之间的果胶质层解掉，并使细胞壁软化，便于压片。解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异。方法是：将固定后（或保存后）的根尖分装到小烧杯内，用蒸馏水漂洗，再加入1N HCl溶液，在60下水解820分钟（洋葱用8分钟，蚕豆侧根用10分钟，玉米用20分钟），解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。（五）漂洗 解离后的根尖用
12、蒸馏水漂洗34次，用吸管吸干水。漂洗时间和次数一定要足够，否则影响染色效果或染不上色（六）染色、压片 将解离漂洗后的根尖放在小培养皿里，滴加改良苯酚品红染色液染色10分钟左右。制片时，取一根尖放在洁净的载玻片上，用刀片切取1mm左右的生长区，其余部分弃掉，加1滴染色液，加盖玻片。用镊子在材料的地方轻压几下，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸用拇指适当用力下压，用解剖针（或竹签）敲击根尖部位，重复几次，力一次比一次大，使材料分散成薄薄的一层，以盖玻片不破裂为准。 （七）观察 将制好的标本片，置于显微镜下先作低倍观察，选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意核及染色体的动态变
13、化。 （八）永久装片 由临时压片材料制做成永久玻片标本，可以将玻片放在CO2干冰或生物切片半导体冰冻机上，待玻片结冰后，取出玻片，用刀片迅速揭开盖玻片，放在空气中干燥后，用封藏剂（加拿大树胶）封固。六、作业 1、每人制作两张洋葱根尖细胞分裂的临时装片。 2、根据自己在实验中观察到的各时期的细胞特点，绘制有丝分裂前期、中期、后期的简图，并能区分各时期细胞的特点。3、解释什么是染色单体？什么是子染色体？子细胞中的染色体与母细胞中的染色体是否相同，为什么？有什么生物学意义？七、学习资料有丝分裂，又称为间接分裂，由W. Fleming (1882)年首次发现于动物及E. Strasburger（1880）年发现于植物。特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于 (动物和高等植物)。是真核细胞分裂产生体细胞的过程。通过有丝分裂，每条染
