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1、爱琴海：现代微生物遗传学课程论文猪链球菌分子生物学分型方法研究进展爱琴海（甘肃农业大学动物医学院 预防兽医系 兰州）摘要: 猪链球菌（Streptococcus suis ,SS）病是一种由不同致病性血清群的链球菌引起，在世界范围内均有分布的人畜共患传染病1-3。根据临床表型的不同，可将本病分为败血型、脑膜炎型、心内膜炎型、淋巴节脓肿型、关节炎型等几种类型4。该病于20世纪50年代中期由Bryante首次发现并报道，随后我国首次在上海也发现了该病病原菌的存在。随着在我国大面积的流行与扩散，该病已成为我国养猪业中最常见、危害最严重的疾病之一5。但由于其种类繁多，鉴定困难，对该病的防控造成了一定的
2、困难。本研究在国内外学者研究的基础上，对猪链群菌的分型鉴定方法做了进一步的归纳总结，这些方法不仅能检测出猪链球菌，而且还能对其做进一步的分型鉴定，为研究和监测该病的流行病学动态奠定了以一定的理论基础。关键词：猪链群菌，分子生物学，分型，鉴定前言经过多年的研究和发展，猪链球菌的分型技术可以分为两大类：一类是以生物学和抗原特性为基础的传统分型方法；一类是分子生物学的方法。前者主要包括细菌形态学的诊断、生化试验以及普遍应用的血清学试验。后者随着分子生物学理论和实验技术的不断完善，在细菌的分型鉴定上得到了广泛的应用，成为临床分离物分型、分析基因型别与疾病之间关系的手段之一6。传统分型方法可对猪链球菌进
3、行初步的定性检测，也作为其它方法的补充或辅助试验。主要的方法有形态学检查、生化试验和血清学试验。在以往的研究中传统的分型方法起到重要的作用，但还是存在不足，如区分度低、难于统一，往往只基于一类表型，描述菌株生物学特性差异的能力差7，故在此不做相关介绍。本文主要从分子生物学的角度出发，对猪链球菌的分型做进一步研究。进而为深入研究该菌的外在表现形式与内在基因之间的关系提供可靠的依据。1.聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）PCR方法解决了猪链球菌生化鉴定的难题，给猪链球菌流调工作带来诸多便捷，其准确、快速的特点使其具有重要的应用前景。截至目前，已发展成功的P
4、CR诊断方法，归结起来有马链球菌兽疫亚种诊断PCR8；有SS定种PCR9；SS定型PCR10如鉴别SS1和SS2，SS1、SS7、SS9和SS14，SS1、SS2和SS9，SS1、SS7和SS9，单纯SS2定型；同时定种定型的多重PCR方法11如鉴定SS1和SS2。同时定种、定型、鉴定毒力基因的多重PCR方法如鉴定SS、SS1、SS2、SS7、SS9、EF、MRP、SLY12；还有同时定型、鉴定毒力基因的实时荧光PCR方法如鉴定SS2和MRP13等。2.16S rRNA基因对猪链球菌进行定型Harel（1998）14等通过分析SS的16S rRNA序列发现，35个血清型中，32、33、34型和
5、其它血清型的亲缘关系较远，其余的32个血清型，根据基因的差异，可划分为一个群。该群的32型细菌可分为3个簇；第一簇包括SS1、SS2、SS12、SS14、SS1/2；第二簇包括与SS7、SS9和SS30；第三簇包括SS20、SS26和SS22。16S rRNA的碱基序列不随外界的条件的变化而改变，可以根据16S rRNA对猪链球菌进行基因水平的定型。3.利用分子伴侣（Cpn60）基因对猪链球菌进行基因分群Ronald Brousseau等（2001）15通过扩增SS的Cpn60基因，并用the neighbor-joining方法绘制的系统进化树中出现了四个群，以距离SS1的差距（X）为标准，
6、第一群为与X0.1的29个血清型；第二群为X1.135的SS20、SS22、SS26；第三群为X0.17的SS33；而X0.26的SS32和SS34为第四群。该方法与16S rRNA的系统进化树相似，比较而言 Cpn60的分辨率更高。所以可以根据Cpn60的高变区设计特异性引物，更好地区分和鉴定猪链球菌的血清型。4.多位点序列分型技术（Multilocus sequence typing，MLST）多位点序列分型（MLST）通过分析多个管家基因的核酸序列，对菌株的等位基因进行同源性的比较，对应生成一个序列型（ST），这样就保证了所有的菌株在同一基因水平上进行遗传进化关系的比较。King等（20
7、02）研究发现同一ST型中可包含不同血清型的SS分离株，而同一血清型的SS分离株也可能在不同的ST型中出现。5.多位点酶电泳分型技术（Multi-locus Enzyme Electrophoresis，MLEE）MLEE是一种在基因水平上，通过研究多个管家酶的变异性，分析鉴定后得到若干不同相应电泳型为目的的分子生物学分型方法。Hampson等和Mwaniki等16应用该方法对猪链球菌的35个不同血清型做了分型鉴定试验，直接证明了该方法在猪链球菌血清型分型工作中具有很高的应用价值。6.限制性内切酶图谱分析分型技术Mogollon等将临床分离到的66株猪链球菌用限制性内切酶酶切后，利用基因指纹技
8、术进行研究表明，该方法能区分猪链球菌的致病菌株，并且能追溯致病菌株的传播情况，对研究和掌握猪链球菌的流行病学特征有重要的意义。但某些内切酶能很好地消化大多数链球菌，但某些血清型却不被消化。7.随机扩增DNA片段多态性分析分型技术（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）Gottschalk等用三对引物对来自不同国家的80株猪源2型菌，8株人源2型菌进行RAPD分析，得到了23个RAPD型。分析结果显示，这两种不同来源的猪链球菌2型菌株具有相同的RAPD型，且代表强毒力基因表型mrp+、ef+、sly+的致病菌株和代表弱毒力表型的mrp-、ef-、sly-
9、的非致病性菌株分别具有着相同的RAPD型。这说明RAPD方法和mrp+、ef+、sly+基因表型有着较为密切的关系，同时也为研究不同来源的猪链球菌菌株提供了很好的方法。倪宏波等17利用100条随机引物对分离的20株猪链球菌做随机扩增多态性DNA（RAPD）分型研究，结合SPSS10.0软件分析了不同菌株之间的遗传距离，绘制出了菌株间的进化树，将20株猪链球菌分为4个聚类，从分子水平上阐述了猪链球菌临床分离株间的亲缘关系。8.脉冲凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis，PFGE）PFGE是通过酶切细菌基因组，然后对酶切片段进行琼脂糖凝胶电泳，不断改变电场方向，
10、从而在凝胶上获得多态性DNA图谱。Vela A I等运用该方法可将西班牙74个畜群的302株猪链球菌分为60个基因型，其中45%的基因型由单一分离株构成。值得强调的是，该试验在同一血清型可以分出多个脉冲电泳型(pulsotypes)，如9、2型、7型可分别获得24、10、6个脉冲电泳型。这就说明许多血清型中可能还存在亚型，而传统的分型方法很难描述同一血清型中菌株间的差异。Marois C等在对来自扁桃体的猪链球菌研究时发现，利用荚膜多糖抗原法进行血清型鉴定时有58%菌株无法定型，说明荚膜抗原分型法不足以区分所有的猪链球菌，而应用PFGE技术进行基因分型在其研究中起到重要的作用。Berthelo
11、t-Herault F等对法国的123个株猪链球菌进行PFGE研究，98%菌株获得定型并可归结为74种脉冲电泳型，按60%同源性归类可获取A、B、C 3个组，而来自临床病猪和人源分离株集中在B组，体现PFGE技术的相当高的区分度，并且分型效果能与临床相关。PFGE具有很高的分辨率，重复性好，但需要特殊的仪器和专业人员操作，可比性不及MLST，较难于统一标准化。不过我国正在建立各病原菌PFGE分析标准化操作规程,建立标准图谱数据库，即不同病原菌各自的酶切分析和电泳参数标准，其应用会越来越广泛。9.核糖体分型技术（Ribotyping）运用核糖体分型(ribotyping)技术对猪链球菌毒力进行研
12、究，经DNA提取、酶切、电泳分离、Southern blot后，用地高辛标记的16 S、23 S rRNA反转录cDNA作探针杂交。结果发现，强毒株具有与弱毒株、无毒株不同的杂交图谱。利用这种方法可以鉴定SS2的毒力。Smits H E等用同位素标记一个1066 bp的16s RNA基因片段作探针与42株猪链球菌的DNA片段杂交，结果显示致病SS2菌株和高致病SS1有不同的杂交图谱，无毒株之间的杂交图谱具有很高的同源性。也有报道说用核糖体分型的方法发现脑膜炎菌株有独特的DNA图谱，并且对磺胺甲异恶唑具有耐药性，而来自肺炎、败血症、心包炎、心内膜炎菌株则属于另一类图谱且对四环素具有耐药性。这种方
13、法涉及Southern印迹和核酸标记，比较耗时，成本高，难以在普通实验室广泛应用。10.基因芯片技术检测猪链球菌郑峰等20根据GenBank中猪链球菌的相关序列，针对猪链球菌种、主要致病血清型及主要毒力相关基因设计的寡核苷酸探针可特异地识别对应靶基因，重复性好，敏感性与特异性高，对于高通量鉴定猪链球菌菌种及其毒力有重要价值。11.PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP法)PCR-RFLP是通过PCR扩增某个特定的DNA片段，然后对该片段进行RFLP分析。Marois C等运用该法对138株猪链球菌进行研究，其选择的PCR扩增片段为部分16 S rRNA基因和部分23 S rRNA基因，
14、以及16 S23 S rRNA基因之间序列(intergenic spacerregion, ISR)，称之ISR-RFLP。结果表明，这种方法可以分辨95%以上的菌株，人源分离株间的基因差异小于猪源分离株，并且有两种基因图谱中为SS2菌株特有。23S rRNA分子比较大(约3 kb)，尚未在细菌的分类和鉴定中得到广泛应用，ISR比16S rRNA相对变异大，因此应用16S23S rRNA基因及ISR对亲缘近的菌株的分类和鉴定可以弥补了16S rRNA序列的缺陷。就特定DNA片段分析而言，PCR-RFLP不及测序准确，但对大片段DNA测序的成本也是相当高。结语与传统的分型方法相比，基于分子生物
15、技术的分型方法体现了高灵敏性，简易性，能从基因水平反映菌株的生物学特性的差异。其中核糖体分型由于其操作复杂，较耗时，成本高，运用该技术对猪链球菌分型的报道不多，RAPD、RFLP技术可以针对全基因组进行分析，RAPD操作最为简易，成本最低。PCR-RFLP和基因测序方法则针对部分基因片段，选择合适的基因片段至关重要，比起PCR-RFLP，测序方法可以精确扫描每个碱基、分辨力极高，不过成本也较高。MLST技术的可比性和PFGE的高分辨率最为突出，并能检测细菌基因组的多个位点，这使这两项技术越来越受青睐。总之，分子生物技术给细菌分型引入了新的思路，正如Zuckerkandl E和Pauling L
16、曾谈到“分子是进化的历史文件”，以分子生物学技术将会成细菌分型的强有力手段，并将会是流行病学研究的重要工具。参考文献1 马玉臣,马俊飞,李长海,等.链球菌致病机理及防治J.畜牧与饲料科学,2010,31(2): 180-181.2 陈陆,王川庆,王江辉,等.河南省致病性猪链球菌耐药性监测报告J.河南农业科学,2005, 3: 74-75.3 赵慧梅,黄素珍.猪链球菌病流行病学及其毒力因子研究进展J.畜禽业, 2007, 5: 8-11.4 付生.猪链球菌病的临床诊断与防治措施J.畜牧兽医科技信息,2009,3:75.5 禹波,李候梅,庞全海.猪链球菌病研究进展J.甘肃畜牧兽医,2006,3:38-40.6 刘国平,胡利群,杨小林,等.猪链球菌鉴定及分型方法概况J.长江大学学报(自然科学版)农学卷
