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1、实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出， 由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比， 它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前 已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知 模板进行定量分析的方法。1. Ct值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。C代 表Cycle，t代表threshold，Ct
2、值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时所经历的循环数(如图1所示)。2.图1. Ct值的确定荧光域值(threshold)的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省 设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 6-153.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线 性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可 作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2 所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算
3、出该样 品的起始拷贝数。图2.荧光定量标准曲线4.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1） TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一 寡核昔酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整 时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5 3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所 示。=1凹1=1凹1=1
4、PfllymerizationPR-OBLSirand DisplacementCleavagePolymerization Completed图3. TaqMan荧光探针工作原理虹谁挞* PRIMERFPRWftRD PRIMLRIt - REPORTERQ = QUENCH ER2） SYBR荧光染料:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地 掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。凹1=11=1二.内标在传统定量中的意义1 .几种传统定量PCR方法简介：1）内参照法
5、:在不同的PCR反应管中加入巳定量的内标和引物，内标用基因工程方法合匹1=1成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可匹1=11=1用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检2）竞争法:选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应匹1=1管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标 记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片 段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测 定荧光强度，根据已知模
6、板推测未知模板的起始拷贝数。3) PCR-ELISA 法: 利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合， 再加入抗地高辛或生物素酶标抗体一辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物 显色。常规的PCR-ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线， 也可实现定量检测目的。2 .内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCRi=i经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR 仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（见图4），因此无法直接从终 点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的
7、 不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的 方法。(巨 ttuuouHalonii:图4.相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性三.内标对荧光定量PCR的影响1 .实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限， 实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通 过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光 定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1） Ct值的重现性凹1=1i=iPCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的
8、指数扩增期（对数 期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同 时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4）2） Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进 行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。2.内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双 重？。双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著7,8。但由于待 测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知
9、模板作为内 标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量 的方法。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比 较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准 曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方。Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧 光定量PCR的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外 标准曲线的方法，而不用内标进行定量。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准 确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、 转基
10、因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域10,11,12,13。参考文献1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.2. DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev. B Applied Biosystems3. 定量聚合酶链反应的研究进展与临床应用.中华检验医学杂志2000, 23(2): 120-121.4. An
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13、 Anal, 1999, 13(1): 40-47.8. Schnell S, Mendoza C. Enzymological considerations for a theoretical description of the quantitative competitive polymerase chain reaction(QC-PCR). J Theor Biol, 1997, 184(4): 433-440.9. Ke LD, Chen Z, Yung WK. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exoge
14、nous vs endogenous standards. Mol. Cell Probes, 2000, 14(2): 127-135.10. Becker K., D. Pan and C.B.Whitely. Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther, 1999, 10: 2559-2566.11. Higgis, J.A., etal. 5 nuclease PCR assay to detect Yersinia pesits. J Clin Mic
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