《医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法A1 仪器和设备高压蒸汽灭菌器。干燥灭菌箱。培养箱：37C。恒温水浴箱。电炉。天平。灭菌平皿。灭菌刻度吸管。酒精灯A2 培养基和试剂乳糖胆盐培养液A2.1.1成分蛋白胨 20g猪胆盐（或牛、羊胆盐） 5g乳糖 5g溴甲酚紫水溶液蒸馏水 1000mLA2.1.2 制法将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH到，加入指示剂，充分混匀, 分装于内有倒管的试管中。115C下灭菌20mi n。贮存于冷暗处备用。三倍浓度乳糖胆盐培养液A2.2.1成分蛋白胨 60g猪胆盐（或牛、羊胆盐） 15g乳糖 15g溴甲酚紫水溶液蒸馏水 1000mLA2.2.
2、2 制法制法同附录A2.1.2。伊红美兰培养基（EMB培养基）A2.3.1 成分蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氢二钾 2g琼脂 20g2伊红水溶液 20mL美蓝水溶液 13mL蒸馏水 1000mLA2.3.2 制法将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使溶解，再 加入蒸馏水补足至1000mL,调整pH至。趁热用脱脂棉和砂布过滤，再加入乳糖，混匀, 定量分装于烧瓶内，115C灭菌20mi n。作为储备培养基贮存于冷暗处备用。临用时，加热融化储备培养基，待冷至60C左右，根据烧瓶内培养基的容量，加入一定量的已灭菌的2伊红水溶液和美蓝水溶液，充分摇匀（防止产生气泡）
3、。倾注平皿备用。乳糖蛋白胨培养液A2.4.1成分蛋白胨 10g牛肉膏 3g乳糖 5g氯化钠 5g溴甲酚紫乙醇溶液 1mL蒸馏水 1000mLA2.4.2 制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH到，加入溴 甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀，分装于内有倒管的试管中o 115C下灭菌20min。贮存于 冷暗处备用。革兰氏染色液A2.5.1 结晶紫染色液结晶紫 1g95乙醇溶液 20mL1草酸铵水溶液 1000mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵水溶液混合。A2.5.2 革兰氏碘液碘 1g碘化钾 2g蒸馏水 300mL将碘与碘化钾混合，加入蒸馏水少许，充分摇匀，待完全
4、溶解，再加入蒸馏水至300mL。A2.5.3 脱色液95乙醇。A2.5.4 沙黄复染液沙黄 1g95乙醇 2g蒸馏水 90mL将沙黄溶于95乙醇中，然后用蒸馏水稀释。染色法染色的基本步骤为：1）涂片：在载玻片上滴加一滴生理盐水，用灭菌的接种环取菌落少许， 与生理盐水混匀，涂布成薄膜；2）干燥：在室温中使自然干燥；3）固定：将涂片迅速通 过火焰23次，以载玻片反面接触皮肤，热而不烫为度；4）染色：滴加结晶紫染色液，染 色1min,水洗；5）媒染：滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗；6）脱色：滴加95%乙醇 脱色，约30s，水洗；7）复染：滴加复染液，复染1min,水洗。革兰氏阳性菌染色后呈紫色，
5、革兰氏阴性菌染色后呈红色。注：亦可用1： 10稀释的石炭酸复红染色液作复染剂，复染时间为10s。A3 检验程序样品处理：确定样品接种量发酵试验：将样品接种于乳糖胆盐培养液 平板分离：将产酸发酵管液接种于EMB 鉴定：挑取可疑菌落革兰氏染色、镜检 鉴定：挑取革兰氏阴性无芽抱杆菌接种于乳糖蛋白胨培养液 计数：根据产酸产气的阳性管数查MPN表 检验结果报告A4 操作步骤样品准备A4.1.1 污水污水样品应至少取200mL,使用前应充分混匀。根据预计的污水样品中粪大肠菌群数确定污水样品接种量。粪大肠菌群数量相对较少的接种量一般为10mL、1mL、。粪大肠菌群数较多时接种量为1mL、或、等。接种量少于1
6、mL时，水样应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量为、时，取稀释比分别 为1:10、 1:100。其它接种量的稀释比依此类推。1:10稀释样品的制作方法为：吸取1mL水样，注入到盛有9mL灭菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。因此，取1mL1:10稀释样品，等于取污水样品。其它稀释比的稀释样品同 法制作。注1：若样品为经过氯消毒的污水，应在采样后立即用5硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。A4.1.2 污泥污泥样品应至少取200g，使用前应充分混匀。根据预计的污泥样品中粪大肠菌群数量确定污泥样品接种量。粪大肠菌群数量相对较少的污 泥样品接种量一般为、。粪大肠菌群数量较多时接种量为、或、等。污泥样
7、品应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量、的稀释样品制作方法如下：！20g 污泥样品，加入到三角烧瓶中，加灭菌水使成200mL,混匀，制成1:10稀释样品。吸取1:10 稀释样品1mL,注入到盛有9mL灭菌水的试管中，混匀，制成1:100稀释样品。按同法制成 1:1000稀释样品。接种1mL1:10、1:100、1:1000稀释样品等于接种、污泥样品。注1：若样品为经过氯消毒的污泥，应在采样后立即用5硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。发酵试验将样品接种于装有乳糖胆盐培养液的试管（内有小倒管）中，44C培养24h。样品接种体积以及管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积根据以下条件确定：样品为污水时，取三个接种
8、量、每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需15个试管。试管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积应根据接种量确定。若接种量为10mL，吸取10mL样品接种于装有5mL三倍浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量为1mL时，吸取1mL样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内； 若接种量少于1mL时，吸取1mL稀释样品接种于装有10mL普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。样品为污泥时，取三个接种量、每个接种量的稀释样品分别接种于3个试管内，共需9个试 管。9个试管中，各装有10mL乳糖胆盐培养液。各个试管接种稀释样品体积均为1mL。平板分离大肠杆菌分解乳糖产酸时培养液变色、产气时小倒管内出现气泡。经
9、24h培养后，将产酸的 试管内培养液分别划线接种于EMB培养基上。置于37C培养箱中，培养1824h。鉴定挑选可疑粪大肠菌群菌落，进行革兰氏染色和镜检。可疑菌落有：1）深紫黑色，具有金属光泽的菌落；2）紫黑色，不带或略带金屑光泽的菌落；3）淡紫红色，中心色较深的菌落。上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取上述典型菌落13个接种于盛有5mL乳糖蛋白胨培养液倒管和倒管的试管内，置于44C培养箱中培养24h。产酸产气试管为粪大肠菌群阳性管。A5 计数根据证实有粪大肠菌群存在的阳性管数，查表A1或A2可得lOOmL污水或lg污泥中粪大肠菌 群MPN值。由于表A1和表A2是按一定的三个10倍
10、浓度差接种量设计的（污水接种量为10mL、1mL和，污泥接种量为、和），当采用其他三个10倍浓度差接种量时，需要修正表内MPN值，具体方法如下：表内所列污水（污泥）最大接种量增加10倍时表内MPN值相应降低10倍；污水（污泥）最 大接种量减少10倍时表内MPN值相应增加10倍。如污水接种量改为1mL、和时，A1表内 MPN值相应增加10倍。其它的三个10倍浓度差接种量的MPN值相应类推。由于A1表内MPN值的单位为每10 0mL污水样品中MPN值，而污水以1L为报告单位，因此 需将查A1表得到的MPN值乘上10,换算成1L污水样品中的MPN值。表A1污水中粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表（污
11、水样品接种量为5份10mL水样，5份ImL水样和5份水样）阳性管数100ML 水阳性管数阳性管数100ML 水100ML 水接种接种接种样中 MPN接种接种接种样中 MPN接种接种接种样中 MPN100ML10ML水样100ML10ML水样100ML10ML水样水样水样水样水样水样水样0000200540013001220174011700242029402210035203124032500472041440430005920516405360102210741017011421194112101262121241226013721314113310149214174143601511215
12、1941542020422094202202162211242126022722214422320239223174233802411224194244402513225224255003062301243027031723114431330329232174323903311233204334503413234224345203515235254355904082401544034041924117441400421124220442470431324323443540441524425444620451724528445690509250174504105111251204514805213252234525605315253264536405417254294547205519255324558110023008500231014301115013110263021350243103
