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1、Western lottn实验环节1蛋白质的样品制备：取心肌组织50m,待组织块自行溶解,用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位,用组织剪尽量将其剪碎,将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部,按mlPA+10uPMS/10mg心肌组织的比例加入RPA和PSF(先加IPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中,匀浆约30分钟。将心肌组织匀浆转移到离心管中,41g离心分钟,收集上清（如有粘稠物进一步用超声解决），样品分装冻存于-20备用。我们实验室采用的是PIERCE的mammalian protein extraction reagent(prod#78501)对组织进行裂解,提取蛋
2、白的.我们也是要用匀浆器对组织运用(prod#78501)进行匀浆解决,然后匀浆后,直接分装,装入冰箱,没有进行离心和收集上清解决这样解决,让我紧张您的目的蛋白的获得量与否足够进行您的目的蛋白检测2 测定蛋白浓度：2.1按50：1配备CA工作液。2.0ul液(蛋白原则）+90lB液稀释成0.5m/ml的蛋白原则液。2.3 分别以0、1、2、4、1、16、20ul将蛋白原则液加入96孔板的第8原则孔中,在其她样品孔中加入10ul待测样品。2.4 分别加BS定容至2u。. 各孔中加入20lBA工作液,室温放置小时。.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562,依原则曲线算出蛋白浓度。BCA法是测量总蛋
3、白含量的,它作为参照指标可以作为western的参照数据,但是您的目的蛋白是多少,恐怕不是那么容易得出,一种措施是运用后来的SDS图的条带估计,一种是加入内参检测,这个诸多人使用,可以参照. SSG电泳：3.1 制胶: 按比例配制分离胶,缓缓地摇动溶液,使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以制止氧气进入凝胶溶液中,静置40m。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不持续系统中下层分离胶上的水分,持续平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制6min以上以保证完全聚合。预电泳:将聚合好的凝胶安顿于电
4、泳槽中，小心拔去梳子,加入电泳缓冲液后低电压0-20V的预电泳20-30n。我们采用的是55V,但是这个作用相似,影响不是很大(目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通)。.3 样品准备：一方面计算上样体积,然后按样品：上样buffer4：1的比例加入上样bufr混匀，沸水煮10分钟，冰上分钟。我们实验室一般把蛋白提前解决,然后分装-20度储藏,4度放置使用,固然您这样冰上5分钟,问题也不大,但注意上样时蛋白混匀.4 加 样： 预电泳后依次加入原则品（Marke）和待分析样品。(加样时间要尽量短,以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边沿效应。每个泳道加5
5、u您确信上5ul就够了么,我觉得这个上样量太小,很用也许您的上样量过小,导致了您的目的抗原的量过少,而导致您的实验不够抱负,我们一般加入20-30ul样本. 这个因素和上面的离心取上清,使我很紧张您的目的抗原量不够!。5 电泳： 加样完毕,选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿达到两胶交界处(一般约20分钟)，更换至00V恒压电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳(一般约为小时20分钟）。转膜：4. 切胶:将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来,测量其长宽,并记录。4.2 剪膜和滤纸:按胶的尺寸剪膜和滤纸(滤纸长宽较凝胶小051mm，PV
6、F膜长宽较凝胶大0.1m）,滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中0秒钟，膜放入盛有1%甲醇的玻璃皿中0秒钟,然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟,进一步放入盛有电转液的玻璃皿中分钟。4. 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”(注意避免两边滤纸互相接触，以免发生短路)。从正极到负极按如下顺序排列：正极海绵双层滤纸DF膜凝胶-双层滤纸-海绵-负极。(其中不能留有气泡)卡紧转膜板，电转槽中倒满电转液,将转膜板浸入电转槽中，注意正负极要对的。插上电源，设定恒流0A转膜,冰箱中过夜。如果您转印完毕后,运用丽春红检测下,那么就懂得您的目的蛋白转印的效果如何了,是一种较好的检测转印
7、与否成功的措施.过夜转印,我此前据说过,但是好象不是诸多人采用,诸多人紧张这样会让转好的蛋白丢失,因而诸多人更加乐意恒压或则恒流的方式转1-2小时,我们是恒流300mA 75-90分钟,视蛋白大小而定,40kD如下的,一般55min 40-85kD的75min,90Kd的90min,温度选择37度或则常温5、膜的封闭: 用TBS液洗涤印迹膜10分钟x2次。放入5脱脂奶粉封闭液内，摇床震动，70转/分钟，室温封闭1小时30分钟。6、一抗孵育：6.1 配制一抗：按相应抗体的效价加入一抗稀释液，一抗稀释液按0.0% BST(ml)：脱脂奶粉（）=20:1配制。6.一抗孵育:将封闭后的膜放入杂交袋中，
8、加入一抗约1l,室温摇床(转/分钟)孵育1小时30分钟。您的膜应当剪的很小吧,如果是这样1ml的一抗应当够了,但是您的孵育时间可以采用4度过夜的措施,这个一般是解决无成果实验的一种非常有用的措施.63用TB洗涤膜10分钟x3次。7、二抗孵育:配制二抗：按相应抗体的效价加入二抗稀释液,二抗稀释液按.5TBST(m)：脱脂奶粉(g）=20：1配制。7.2 二抗孵育:将一抗孵育后的膜放入二抗中,室温摇床（70转/分钟)孵育1小时30分钟。7. 用BST洗涤膜10分钟x3次。8、CL显色8.1 配制E工作液：在避光的容器中按A液:B液=：1的比例配制。8.2 按膜:工作液10cm：1l的比例将ECL工
9、作液覆盖到膜表面，放置12分钟后在凝胶成像系统中观测、拍照。我们的实验过程如下:电泳:SD-PAGE； 预电泳 恒压55 mn，上样5ul， 恒压55 4 i左右，当样品至分离胶面时,恒压 ,到考马斯亮蓝至底部，停止电泳。转印：制作转印三明治,150 m。8%-90 mn,10%-0min，12-50m。中断转印,有条件可以运用丽春红检测总蛋白转印与否成功。封闭:将转印膜取出，用去离子水清洗,TBST洗一次5 Mn后，加入%的脱脂牛奶封闭,于度封闭小时。(注意封闭液，一抗稀释液,二抗稀释液均具有脱脂牛奶，可以配成含0.0%硫柳汞的溶液以免牛奶变质)洗膜次,0 in，一抗孵育:一抗浓度1：100(牛奶抗体稀释液）,度孵育过夜洗膜4次，每次5 n二抗孵育:二抗浓度1：300(.%牛奶抗体稀释液）,8度孵育1.52 洗膜4次,每次15 min（建议洗膜完毕后,不要立即显色，静置或者轻摇1.5h-2h后再显色）显色：注意显色时间的控制和曝光时间的控制祝您工作顺利,实验顺利!
