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1、关于RNA制备的技术解答1、RNase是RNA制备的杀手RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。2、塑料制品、玻璃和金属物品的处理(a)塑料制品：尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明RN
2、ase-Free的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理方法如下：(1) 在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。(2) 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。(3)在通风柜中室温处理过夜。将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。(5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。(b)玻璃和金属物品250P烘烤3小时以
3、上。3、采用什么方式纯化总RNA?答：我们提供多种RNA纯化方式，根据您对RNA纯化技术的熟悉程度，选用不同的纯化手段。从产品使用效果看，基于TriBlue的一步法分离总RNA试剂盒(K311,K321系列)无论是新手还熟手都可以得到比较理想的结果。如果您对苯酚过敏，出于对环境的保护，您可以选用整个分离流程都不使用苯酚的试剂盒(K361系列)。从产品形式上，我们的总RNA分离分醇沉淀离心式和离心吸附柱方式两种。沉淀方式总的产量比较高，纯化规模机动，但是纯度不及吸附柱方式；吸附柱方式操作比较简单，纯度高，受吸附容量的影响，产量收到影响。4、什么时候需要分离mRNA?答：常规RT-PCR鉴定基因表
4、达水平的，一般都可以采用总RNA作为RT-PCR的模板，但是做cDNA文库，克隆丰度极低的基因，大多数DD-PCR，削减杂交等需要纯化的mRNA。一般用oligo（dT）-cellulose或在磁珠上偶连oligo（dT）,从组织或总RNA种直接分离mRNA。5、如何判定分离的总RNA的纯度？答：需要从两个方面着手,缺一不可,特别是新手（1）测定OD260/OD280的比值,测定时，RNA需要用10mMTris-HCl,pH7.5稀释。理想的RNA,OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。（2）琼脂糖变性电泳观察rRNA的完整性和强度。
5、变性电泳需要采用MOPS系统，不可以采用DNA电泳用的TBE或TAE系统。如果OD260/OD280过低（1.7），通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现。6、什么时候需要加入RNA-Carrier?答：样品很少或样品中RNA含量低，制备RNA时需要加入一定的RNA载体，以提高RNA纯化的得率。常用的载体有PolyAcrylCarrier,PolyA,PolyC和Glycogen。一定浓度范围的Carrier对一些RNA的下游应用没有影响，如RT-PCR,NorthernBlot。7、如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNA?答：无论用种方式制备的总RNA,要绝对保证不含基因组DNA是不现实的
6、。如果您希望得到DNAfree的RNA样品，需要用RNasefree的DNaseI处理。&纯化的RNA样品如何保存？答：如果希望得到最佳的结果，纯化的RNA需要立即用于下游实验。RNA可以保存在-80C冰箱，长期保存可以置于液氮中。如果没有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在异丙醇或乙醇中，-20度保存。9、组织和细胞样品如何收集，保存？答：组织样品收集后，需要立即保存在液氮中，或在样品中加入一定量的保护剂，有一些商业化的产品可以选用。一般实验收集50-100mg组织就足够了。10、如何估计RNA的产量？答：能计算出RNA的产量，通常都是有比较多的起材料，但是很多情况下能够取得材料很少，所制备
7、得到的RNA无法通过分光光度的方法测定含量和浓度。RNA的含量与组织和细胞的类型有比较大的关系，同时与抽提的方式有关，例如用抽提小鼠组织100mg肝可以得到500ug总RNA,100mg肺得到200ug总RNA,1百万个细胞Hela细胞可以得到15ug左右的总RNA.mRNA的含量一般占总RNA含量的2-5%。根据这样一些经验值，估算出您可能得到的量。样品如果低于20mg或10000个细胞，在抽提时需要考虑加入合适的RNA沉淀载体。11、RNA制备过程中那个环节要特别注意？答：一般情况下，细胞和组织在RNA抽提液中都可以保存一段时间，因为几乎所有的RNA的抽提裂解液中都含有高浓度的异硫氰酸胍等
8、强变性剂，RNase基本是不起作用的，操作即使是粗放一些，也没有多达关系。但是通常是离心后取上清，这时候RNA已没有保护，操作要特别小心。RNA质量检测与鉴定方法一、检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看0D260/0D280（Ratio，R）。1.8-2.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2的）。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。方法二、RNA的电泳图谱一般的，RNA的
9、电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNAsmear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非
10、常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。方法三、保温试验方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000ng的RNA加入至0.5ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70的恒温水浴中，保温1h。另一份放置在-20C冰箱中保存1h。时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70C保温的样本有明显的降解，贝I说明RNA溶液中有RNA酶污染。
