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1、大肠菌群分布较广,在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明,大肠菌群细菌多存在于温血动 物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方,人、畜粪便对外环境的污染是大肠菌群在自然界存 在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主,而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的,主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠 菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物,其 中有健康人粪便,也有肠道患者或带菌者的粪便,所以粪便内除一般正常细菌外,同时也会有一些肠道致 病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等),因而食品中有粪
2、便污染,必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一,目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。大肠菌群名 称并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一个或某一属细菌,而指的是具有某些特 性的一组与粪便污染有关的细菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,其定义为:需氧及兼性厌 氧、在37C能分解乳糖产酸产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、 柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。第一节 大肠菌群标准检验方法一、检验方法(一)检样稀释1. 以无菌操作将检样25mL(或25g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他
3、稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶 内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成 1:10 的均匀稀释液。固体检样最好用均 质器,以800010000r/min的速度处理lmin,做成1:10的均匀稀释液。2. 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇 试管混匀,制成1:100的稀释液。3. 另取1mL灭菌吸管,按上项操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸 管。4. 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度接种3管。(二)乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL
4、以上者,用双料乳糖胆盐发酵管;1mL及1mL以下者, 用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置361C温箱内,培养242h,如所有乳糖胆盐发酵管 都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。(三)分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置361C温箱内,培养1824h,然后取出,观察菌落 形态,并做革兰氏染色和证实试验。(四)证实试验在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落12个,进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置361C温箱 内培养242h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳 性。(五)报告根据证实为大肠菌群阳性的
5、管数,查MPN检索表,报告每100mL (g)大肠菌群的最可能数。(六)检验程序大肠菌群检验程序如图 2-1。图 2-1 大肠菌群检验程序(七)大肠菌群 MPN 检索表大肠菌群最可能数(MPN)检索表如表21。表2-1大肠菌群最可能数(MPN)检索表阳性管数mpn100ml (g)95%可信限1ml(g)X30.1ml(g) X30.01ml(g)X3下限上限00030001300026059000390010300116051300129001312002060021900221200231600309003113003216003319010040101705200102110102101
6、031501070111110102301121503036011319012011012115030360122200123240130160131200132240133290200902011401036020220030370203260210150304402112007089021227021334022021022128040222350100470223420150023029023136023244023353012003002304030139070302640150130030395018004307502100310703111403121200300230031316
7、003800930380032015001503213003223504400323210047002900330360331240071013000332150033346002400011000 三2400048000注: 表采用3个稀释度ImL (g)、O.lmL (g)和O.OlmL (g),每稀释度3管。内所列检样量如改用10mL (g)、ImL (g)和O.lmL (g)时,表内数字相应降低10倍;如改用O.lmL (g)、0.01mL(g)和O.OOlmL (g)时,则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。二、结果分析判定(一)检验步骤大肠菌群的检验步骤采用三步法(即乳糖发酵试验
8、、分离培养和证实试验)。第一步乳糖发酵试验是样品 的发酵结果,不是纯菌的发酵试验,所以初发酵阳性管,不能肯定就是大肠菌群细菌,经过平板分离和证 实试验后,有时可能成为阴性。大量检测数据表明,食品中大肠菌群检验步骤的符合率,初发酵与证实试 验相差较大,不同食品三步骤的符合情况也不一致(见表2-2),所以在大肠菌群检验步骤方面,应结合 食品类别、污染情况以及样品中菌相的差异分别予以考虑。在食品检验上,除个别情况外,一般来说,如 果平板上有较多典型大肠菌群菌落,革兰氏染色为阴性杆菌,即可作出判定。如平板上典型菌落甚少或均 不够典型,则应多挑菌落做证实试验,以免出现假阴性。只作一步初发酵,对某些食品来
9、说,误差是比较 大的。这样做,会有相当部分的合格样品被作为不合格样品处理,应予注意。表2-2 检验步骤与检出率的关系种类样品名称检出阳性率b/aX100%c/aX100%c/bX100%初发酵(a)平板分离(b)证实试验(c)食品羊肉483483483100100100熟肉29821821573.272.198.6灌肠54054053910099.899.8生牛奶45043943997.697.6100甜炼乳16314010085.961.371.4奶粉77747496.196.1100醋118413834.732.292.7酱油31326525884.782.497.4冰棍、雪糕、冰 砖74
10、349346066.461.993.3汽水121212100100100炊具(碗)109109109100100100合计3 3062 8142 7278582.596.9(二)产气量在糖发酵试验工作中,经常可以看到在发酵倒管内存有极微小的气泡(有时比小米粒还小),类似这样的 情况能否算作产气阳性,这是许多食品检验工作者经常遇到的问题。实验表明,大肠菌群的产气量,多者 可以使发酵倒管全部充满气体,少者可以产生比小米粒还小的气泡。一般来说,产气量与大肠菌群检出率 呈正相关,但随样品种类而有不同,小于小米粒的气泡,亦可有阳性检出(约为30%50%)。另外,对 未产气的乳糖发酵管是否均应作阴性处理,
11、根据大量工作实践来看,对这种情况应予慎重考虑。在日常工 作中,有时可以遇到在初发酵时产酸无气,但复发酵时却有气体产生。有时倒管内虽无气体,但在液面有 泡沫或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。所以对产酸但未产气的乳糖发酵管如有疑问时,可以用手轻轻打动试 管,如有气泡沿管壁上浮,即应考虑可能有气体产生,而应作进一步观察。这种情况的阳性检出率可达半 数以上。(三)产气与倒管在工作实践中,有时可以遇到在初发酵时产酸,但倒管内无气泡产生,复发酵却证实为大肠菌群阳性。有 时倒管内虽无气体,但在液面及管壁却可以看到小气泡。为此,有的实验室对倒管能否影响产气的正确观 察进行了实验研究。结果指出,倒管管口的完整情况与倒
12、管外有否沉渣存在均可影响产气反应的观察。管 口不完整有利于气体进入倒管,管口周围有沉渣物质能阻碍或延缓气体的进入。(四)挑选菌落大肠菌群是一群肠杆菌的总称,大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠杆菌更为复杂和多样,而且与大 肠菌群的检出率密切相关。所以在实际工作中,为了提高大肠菌群的检出率,应当熟悉大肠菌群菌落的色 泽和形态。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基,在该平板上,大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或 无光泽时,检出率最高;粉红色菌落检出率较低。菌落形态的其他方面(如菌落大小、光滑与粗糙、边缘 完整情况、隆起情况、湿润与干燥等)虽亦应注意,但不如色泽方面更为重要(见表 23)。另外,挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系,在实际工作中,由于工作量较大,通常只挑取一个菌 落,但影响大肠菌群检出