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1、胶体金技术总结II胶体金技术资料II胶体金试剂条(卡)的制备1. 胶体金标记物的制备包括以下步骤：标记前蛋白的处理，最佳标记pH值，蛋白最适标记浓度。1.1 胶体金联接机制研究人员普遍接受的理论为：三种特异的氨基酸残基在金颗粒与蛋白质的联接 作用中发挥着重要的作用。而赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸这三种氨基酸与胶体金联 接的作用机理各不相同。a. 赖氨酸带有较强的正电荷，因而自然吸附带负电荷的金颗粒；b. 色氨酸主要通过疏水相互作用与胶体金相联接；C.半胱氨酸通过SH-与金表面以共用电子的形式形成配位键。抗体通过这几种作 用力与胶体金颗粒牢固、稳定的、不易分离的结合在一起。1.2 待标记蛋白质的处理
2、：a. 透析除盐蛋白质溶液内应除去多余的电解质，不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的 Zeta 电位，影响蛋白质的吸附，因此，标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入 透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水(0.005mol/l NaCl , pH7.0)透析。b. 去除蛋白质中的沉淀长期低温保存的蛋白质或4C较长时间保存的抗体，特别是在浓度高于2mg/ml 的情况下，很容易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影 响，因此，标记之前须离心以除去这些聚合物。1.3最佳pH值的确定一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时(pH=PI+0.5pH),蛋白 质呈电中性，此时
3、蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子 的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋 白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互 接触，而使胶体金处于稳定状态，如果低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷， 胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白质等电点 时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合。胶体金技术资料II需要提高胶体金的pH值时可用K2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用稀 HC1。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸 测定其pH即可。可
4、按照以下步骤进行：a. 取若干个1.5ml试管，分别加入1 ml 10 nm胶体金；b. 用 25 mM K2CO3 将 pH 分别调为 3，4，5，6，7，8，9，10；c. 取一 96孔培养板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100 ul加入孔中， 重复三次；d. 每孔分别加入3 ul浓度为1mg/ml的待标记蛋白（蛋白浓度宜过量），混合，室温下放置10-15 min；e. 每孔分别加入20 ul浓度为10% NaCl溶液，混合，室温下放置10 min；f. 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH（X）；g. 重复（1）-（5）步，pH 梯度为 X-0.6； X-0.3； X； X
5、+0.3； X+0.6； X+1。h. 观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持红色的最低pH。1.4待标记蛋白质最适稳定量的测定先确定标记的最佳pH值，并调节胶体金溶液pH值。a. 光电比色法制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液，分别加入5ml胶体金（已调节好pH值）中，迅速混匀，然后各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各r Ij3门肪巾恫管。根据胶体金颗粒的大小，OD 在最高吸收峰进行测定，以OD值 为纵坐标，蛋白质用量为横坐标 作一曲线，取曲线最先与横轴相 接近的那一点处的蛋白质用量为 最适稳定量。右图10nm的胶体金 溶液中蛋白质的最适稳定量为 45yg
6、/ml。b.目测法将待标记的蛋白质逐级稀释后，各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金（已 调节好pH值）的试管中混匀（由5gg45yg，另设对照管），5min后，在上述各 管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表1顺序进行。胶体金技术资料II表1具体的做法是按表内进行官数12345678910胶体金（mL）1111111111蛋白质（mL）51015202530354045010%NaCl (mL)0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1 当分别加入0.1ml 10%氯化钠后、混匀静置2h以上观察结果。 没有加入蛋白质的管为对照管。 未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金
7、的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现 象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金的红颜色不变。其中 含蛋白量最低的试管即含稳定1ml胶体金的必须蛋白量。在此基础上再加上 10-20%即为稳定所需蛋白质的实际用量。当然，在最佳 pH 值和蛋白浓度的确定上，以上方法也被直接忽略，这点上就 显现了经验派大神们的过人之处。1.5 蛋白质的胶体金标记步骤当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步 骤如下：a. 根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量。b. 在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调），加入蛋白质时 应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5
8、min加完。C. 在磁性搅拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其终浓度为1%，（和）或加 入3%聚乙二醇（PEg MW20000）使其终浓度为0.05%。1.6 胶体金标记蛋白质的纯化纯化的目的是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金以及在标记过程 中可能形成的各种聚合物。一般在10nm以上所标记的胶体金均在可调整离心机上离心，小于10nm颗粒 的胶体金用超速离心机离心，在4C离心1h左右，弃上清，将沉淀以原体积的 0.02mol/l TBS pH8.2 （内含1%BSA，0.05%叠氮钠）溶解，重复离心23次，沉淀 溶于原体积的1/10TBS中，4C保存备用。为了得到颗粒均匀一致的免疫
9、金试剂， 上述粗提制剂可用 10%30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集不同大小 颗粒的胶体金标记蛋白制剂。注意事项a. 不同直径胶体金所需要的蛋白量差别很大；b. 不同直径胶体金所需离心速度完全不同。以绝大部分探针形成松散沉淀为原 则。离心力太大，会产生不可逆的探针凝聚；离心力太小，探针无法沉下。最 好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当的离心力。c. 在冷离心机中可适当延长离心时间，同时适当减小离心力，探针活性较好。d. 标记物离心时重悬浮的沉淀是松散的，非常好复溶。如果沉淀不容易复溶，可 能是离心速度不合适或者存在过多的未饱和或未标记的胶体金颗粒。可以弃去 该沉淀。1.7 免
10、疫金探针的质量鉴定金标记蛋白的特异性与敏感性测定：将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤 纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）检测相应的抗原或 抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。1.8 交联物的稳定随着特异蛋白的结合，交联物必须用适当的试剂进行稳定，通常使 用BSA、明胶、PEG （聚乙二醇）或酪蛋白。使用稳定剂有双重功能， 一是它可通过封闭胶体表面未和特异性蛋白结合的位点而减少了非特异 性反应；二是它可有助于更稳定的悬液的形成。2. 金标结合垫制备2.1 缓冲液成分将标记蛋白试剂加到结合垫上时所使用的缓冲液应该尽量地简单。首先因为吸 附在胶体金颗粒上的蛋白试剂在
11、干燥后必须保持活性，用于使抗体及其他液态的生 物试剂稳定的化合物经常会与干燥储存不相容，也因为它们改变了试剂的生物活性 或者在物理或者化学上破坏了颗粒。因此，不应该在包被缓冲液里使用盐类和去垢 剂。对胶体金颗粒，推荐的缓冲液是2mM, pH7.0的硼酸盐，并添加1%蔗糖或者 海藻糖。硼酸盐提供了缓冲能力，并且也有一点表面活性剂的性质，对颗粒的重新 溶解有帮助。蔗糖（或者海藻糖）的作用是稳定剂和重溶解，当胶体金标记物在有 糖的条件下被干燥时，糖分子会形成包裹着颗粒的一层，帮助稳定生物学结构。当 样品进入垫子，糖分子立即溶解，带着颗粒从膜表面进入到液流中。经典的组成是缓冲液+（BSA、PEG200
12、00、蔗糖、海藻糖）+（吐温-20、tritonX-100）+NaN3+其他物质（消除干扰因素）。2.2 结合垫包被A. 包被：将配制好的标记物溶液包被于玻璃纤维或其他适宜材料上，常见有溶液 浸泡法、手工涂布法、喷金仪喷涂三种方式。不论采取何种方式，最终要达到 的目的是将标记物均匀分布于材料上，这也正式挑战生产工艺的可靠性之一。a. 溶液浸泡法：简单易操作，但浸泡法最终残留液体较多，成本浪费较大。其次， 浸泡法使用的是过饱和原则，在结合垫转移过程中容易导至液体渗漏而造成不 同张材料、同一张材料的不同位置上含有标记物的有效浓度不均匀。有设备供 应商制造了一种专门用于浸泡法的设备，该设备利用压辊的
13、方式，将浸泡后的 结合垫多余的液体除去，在一定程度上减少了上述差异。但是否能够达到均一 性要求，有待于实际使用验证。b. 手动涂布法：相比较于浸泡法，涂布法可以保持每一张材料的包被液体量相对 更均一，但溶液需要更熟练的操作者进行均匀涂布，否则也容易导至批内的 CV 较大。c. 喷金仪喷涂法：这种方法更精确定量，喷涂的均一性也更好。但据实际使用者 介绍，相较于熟练的手工涂布法，设备受限于产能、效率上远远不及手工，而 且在均一性上相差不明显。B. 干燥：为了提高标记物的性能，处理过的垫子需要尽可能快速并且彻底地干燥。 以下列出了一些特定的选择：a. 常温空气干燥：在一间受控的房间里进行干燥（温度保
14、持18-26 摄氏度，湿度低于20%RH） 24h,在这种环境下进行干燥的结合垫可以保持良好的生物活性， 结合垫的稳定性也能够保持2 年以上。b. 高温空气干燥：在干燥过程中加上热力（如37摄氏度）以帮助除去结合水。 这个方法可以有许多应用，隧道烘箱、干燥箱或受控的干燥房间。要注意某些 生物分子可能是热不稳定的，而缩短时间来保护活性要和彻底干燥进行平衡。 另外，需要注意的是，由于边缘效应的问题存在，热干燥过程中，边缘的水份 挥发比中心快，导至液体流向于四周，干燥后的由肉眼可见的斑纹、边缘颜色 深而中心浅等不均匀的现象。c. 真空冷冻干燥：冻干机及冻干工艺的使用在食品、药品、医疗器械领域已经广
15、泛使用，最大的优点是能够保持蛋白的生物活性，冻干颗粒的疏松状也有利于 后续层析过程中，颗粒的复溶解。相对于空气干燥工艺，能够避免边缘效应的 产生。但要注意的是，严格的工艺验证得出不同批量下的冻干工艺，不得超出 范围使用。冻干机的稳定性也是关键，冻干过程的异常终止将会带来巨大损失。d. 真空干燥：在真空下，水份的沸点降低，这个过程可以加速水份蒸发，相对来 说所需要的时间较短。和空气干燥类似，依然存在边缘效应。e. 支撑物：无论上述何种干燥方式，在干燥过程中均需要用于支撑结合垫的材料， 需要避免的是支撑物的被腐蚀。支撑物的日常清洁也是非常必要，防止交叉污 染。另外，结合垫与支撑物的接触也需要给予特别关注，接触方式（是否水平） 以及接触点大小均会导至结合物液体的分布不均。C. 储存条件：很重要的是，标记物一旦被干燥在垫子的材料上，就要保存在相对 湿度 20%的环境下，温度可以介于18-26C之间。如果垫子暴露在较高的湿度 下，水会和糖分子结合，使它们变成糖浆，延缓了颗粒的重新溶解。3. NC 膜包被3.1 缓冲液成分许多缓冲液都可以用来控制捕获性试剂溶液的pH值，比如醋酸盐、磷酸盐、 硼酸盐、TRIS和碳酸盐。如果试剂溶液用一级胺（如TRIS或甘氨酸）来缓冲，捕
