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1、猪心细胞色素C的制备与测定及分子量的测定摘要：从猪心中通过溶解、沉淀、透析等方法将细胞色素C提取出来，再采用消光法鉴定 及测定细胞色素C,测定细胞色素C的产量、纯度及产率。然后，测定细胞色素C溶液的 光吸收值，并绘制吸收曲线。最后，采用SDS电泳法来测定猪心细胞色素C的分子质量， 绘制标准曲线图，在图中查出细胞色素C的分子质量。关键词：猪心，细胞色素C,透析，消光，SDS电泳前言：细胞色素C (cytochrome c)是细胞色素一种，又称细胞色素丙。由牛、马、猪心或 酵母分离而得，氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。分子量13000。等电点pH 值10以上。它在线粒体呼吸链上位于细胞
2、色素B和细胞色素氧化酶之间，是呼吸链的一个 重要组成部分。在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。通常外 源性细胞色素C不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素C便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，提高氧的利用。通过细胞色素 C可以 判定生物关系的远近，亲缘关系越近的生物，其细胞色素C越相似或相同。向心肌中加入三氯乙酸溶液，一起进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素则 存留在三氯乙酸溶液中。将硫酸铵粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红 蛋白、血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C仍存留于溶液中。进一步用三氯乙酸酸化此溶 液，细胞色素C就沉淀
3、下来，然后透析。在5 5 0毫微米波长下，细胞色素的克分子消光值 为：氧化型细胞色素C：K1=0.9X10分子/克分子/厘米；还原型细胞色素C：K2=2.77X10/克分子/厘米。通过透析用消光法鉴定及测定。用SDS电泳测定细胞色素分子质量。SDS是一种阴离子去 污剂，能断裂分子内和分子间的氢键。它与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并 使其稳定地存在于均一的溶液中。当蛋白质的分子质量在15KD到200KD之间时，电泳迁移 率与分子量的对数呈线性关系。因此被应用于蛋白质分子量的测定。1. 材料1.1试剂1.1.1猪心细胞色素C制备与测定试剂猪心10%氢氧化钠溶液(100克/升)硫酸铵粉末
4、20%三氯乙酸溶液(200克/升)0.145mol/L三氯乙酸溶液饱和硫酸铵溶液10mmol/L铁氰化钾溶液饱和连二亚酸钠溶液1.1.2猪细胞色素C分子量的测定试剂A液：30% (w/v)丙烯酰胺、0.8% (w/v)双丙烯酰胺B 液：75ml 2mol/L Tris-Hcl(pH8.8)、4ml 10%SDS、21ml 蒸馏水C 液：50ml 1mol/L Tris-Hcl(Ph6.8)、4ml 10%SDS、46ml 蒸馏水电泳缓冲液：3g Tris、14.4g甘氨酸、1gSDS加蒸馏水至1L，pH8.3左右5x 样品缓冲液：0.6ml 1mol/L Tris-Hcl(Ph6.8)、5ml
5、 50%甘油、2ml 10%SDS、0.5ml 2-巯 基乙醇、1ml 1%漠酚蓝、0.9ml蒸馏水染色液：0.5g考马斯亮蓝R-250脱色液：200ml乙醇、50ml乙酸，定容500mlTEMED过硫酸铵1.2仪器1.2.1猪心细胞色素C制备与测定仪器大烧杯、玻璃棒 组织捣碎机 细布 大玻璃漏斗 大布氏漏斗 透析袋 PH试纸2100型紫外可见分光光度计磁力搅拌器1.2.2猪细胞色素C分子量的测定仪器微型凝胶电泳装置电源（电压300V,电流500A）100 C沸水浴 Eppendorf 管 微量注射器 脱色摇床2. 操作 2.1猪心细胞色素C制备与测定的操作步骤 2.1. 1猪心细胞色素C的制
6、备取猪心若干，剔除脂肪，称量，绞碎。加入0.145mol/L的三氯乙酸溶液（加入量按1000g/L 心肌组织计算），搅匀抽提。将此混和抽提物于室温下放置3小时，然后用细布过滤。用10% 氢氧化钠溶液将上述混合液调到PH7.3，测量并记录此抽提液的体积，再于搅拌下慢慢地加 入硫酸铵粉末（加入量按500克/混合液计算）。用布氏漏斗抽滤，出去沉淀。经常更换滤纸， 收集粉红色滤液。测量并记录此滤液的体积，搅拌下再加入硫酸铵粉末，（加入量按50克/ 升滤液计算）。此盐析液于冰箱中放置过夜。上述盐析液经放置后出现少量沉淀，用布氏漏斗抽滤（双层滤纸），出去沉淀，保留上 清液，向上清液中加入20%三氯乙酸溶液
7、（加入量按25毫升/升上清液计算），以沉淀细胞 色素C。迅速地于3500转/分条件下离心10分钟，收集细胞色素C沉淀，再将这个砖红色 的沉淀悬浮于饱和硫酸铵溶液中（饱和硫酸铵的体积按150毫升/公升心肌组织计算，可根 据实验操作情况减少30-50%）。将此悬浮液移于透析袋中，对水透析4-5小时，离心（3500 转/分，10分钟）除去少量暗黄色沉淀，红色的细胞色素C溶液则应贮于零下15C。记录此 溶液体积。2.1.2测定细胞色素C的产量、纯度及产率氧化型样品的消光值E按下表加入试剂及样品，于550毫米,波长下测出氧化型样品消光值试目样品（毫升）空白（毫升）0.1mol/LPH7.4磷酸钠缓冲液3
8、.85.8适当稀释的细胞色素C溶液2.00铁氰化钾溶液（0.01mol/L）0.20.2还原型样品的消光值E2：按下表加入试剂及样品，于550毫微米波长下测出还原型样消光值。试剂一MM_样品（毫升）空白（毫升）0.1mol/LPH7.4磷酸钠缓冲液3.85.8适当稀释的细胞色素C溶液2.00饱和的连二亚硫酸钠溶液0.20.22.1.3测定产品的分光光度吸收值将上述操作中的氧化型及还原型溶液取来测定可见光不同波长下的吸收值，绘出吸收曲 线（波长一光密度值）。2.2猪心细胞色素C分子量测定操作步骤2.2.1灌制分离胶将玻板洗净，夹好，然后配制分离胶，加入试剂如下：两块14%的分离胶，需12mlA
9、液5.6mlB 液3.0ml蒸馏水3.4ml10%过硫酸铵0.1mlTEMED 0.01ml混合后，加入制胶室中，缓慢加蒸馏水压平，聚合。2.2.2灌制堆积胶A 液0.67mlB 液1.0ml蒸馏水2.3ml10%过硫酸铵0.03mlTEMED 0.005ml加入制胶室中，加上梳子，聚合后拔出梳子，加好电泳缓冲液，加样。2.2.3电泳调电压150，电泳80分钟左右，指示剂到底部即完成。2.2.4染色剥胶后用染色液染色15分钟，再用脱色液2小时即可看见条带。2.2.5拍照、量距离，测定分子量3. 数据记录与处理3.1测定细胞色素C的产量、纯度及产率E0.070，E0.098A280=0.752,
10、 A260=0.723蛋白质浓度（mg/ml） =1.45XA280-0.74XA260=0.555mg/ml总蛋白量：0.555X50=27.75mgY1=E1/K1XMwtX3XVml=14.47mgY2=E2/K2 X M： X 3 X Vml=6.58mg产率=（Y+y2）/2 /M=54.65mg/kg纯度%=（Y1+Y2）/2 /总蛋白量=37.93%3.2测定产品的分光光度吸收值1.0000.600图1氧化型细胞色素C分光光度吸收值0.8000.4000.2000.000波长系列1氧化型的最大吸收峰在410毫微米，530毫微米。图2还原型细胞色素C分光光度吸收值系列1波长还原型最
11、大吸收峰在415毫微米，520毫微米及550毫微米。3.3细胞色素C的电泳结果的显示如图3.4分子量测定L单位：厘米L11Rf10.149L 总 6.7L21.6Rf20.239L32.5Rf30.373L43.6Rf40.537L54.4Rf50.657L65.4Rf60.806L4.5Rf0.672标准蛋白分子的质量成分分子质量分子质量对数值牛血清白蛋白662004.821兔肌动蛋白430004.633牛碳酸酐酶310004.491胰蛋白酶抑制剂201004.303鸡蛋清溶菌酶144004.158多肽62003.792所测细胞色素C的R户0.672，由所绘图可得细胞色素C的分子量Mt=11
12、541.929。4. 分析讨论4.1本次实验所得的猪心细胞色素C的产率、纯度均较好。在本次实验过程中应尽可能除掉 猪心中的韧带、脂肪和积血；使用离心机之前，一定要配平；透析之前要检查透析袋。在制 备分离胶时不可用玻璃棒搅拌。4.2细胞色素C的分子量约为13 000,肽链中含有19个赖氨酸残基，为一碱性蛋白,等电点 (10.510.8 )高，易溶于酸性溶液,故采用酸化水提取。4.3离子交换树脂，是一种具有离子交换能力的高分子化合物，化学性质稳定。在离子交换 过程中，溶液中的细胞色素C带正电从溶液中扩散到交换树脂的表面，然后穿过表面，又 扩散到交换树脂颗粒内，这些离子与交换树脂中的离子互相交换，交换出来的离子扩散到交 换树脂表面外，最后再扩散到溶液中去。这样当溶液和树脂分离后，其组成都发生了变化， 从而达到分离纯化的目的。事实上，离子交换层析包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、 离子亲和等物理化学过程，是综合作用的结果。1参考文献tMgol分子量测定y = -1.4353x + 5.02681马志科、咎林森、张双奇秦川牛心肌细胞色素C提取纯化及鉴定的研究2007-03-30
