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1、揭阳职业技术学院毕 业 论 文设计题目：啤酒生产中双乙酰调控的研究进展学生姓名：林联欢指导教师：郑燕丹系部：师范教育系专业：生物教育班级：091班学号：09244114提交日期：年 月 日辩论日期：年 月 日年 月 日啤酒生产中双乙酰调控的研究进展摘要双乙酰是啤酒中重要的风味物质，也是啤酒成熟的重要标志。控制啤酒发酵液中双乙酰的含量可以缩短发酵周期，提高啤酒品质。本文综述了啤酒生产过程中双乙酰的形成机制和调控方法的研究进展。关键词：啤酒酵母；双乙酰；调控双乙酰(Diacetyl)是酿酒酵母在啤酒发酵过程中产生的一种重要副产物，是影响啤酒风味的重要物质，同时也是啤酒成熟的限制性指标。它具有挥发性
2、和强烈的刺激性，当其含量过高时(淡色啤酒中015mgL)，啤酒就会呈现出馊饭味，严重的破坏了啤酒风味和感官质量。啤酒酿造过程影响发酵周期的主要因素之一就是双乙酰1。啤双乙酰含量在啤酒发酵过程中增加，在啤酒后熟过程中降低，因此,在啤酒生产中，如何，快速降低发酵液中的双乙酰含量来促进啤酒成熟，从而缩短发酵周期，提高啤酒的质量，一直是啤酒生产企业关注的实际问题，也是相关科研人员的重要研究课题12-91。1双乙酰的形成及分解途径最初，双乙酰被认为是啤酒中污染的乳酸菌所产生，但至二十世纪六十年代，研究者们发现，双乙酰是酵母正常的中间代谢产物1在啤酒发酵过程中，酿酒酵母会产生大量的a一乙酰乳酸，由于a一乙
3、酰乳酸的合成和分解代谢不平衡。导致Ot一乙酰乳酸在酵母中不断积累。其中的一局部分泌到细胞外进入啤酒发酵液中，进一步经过非酶促氧化脱羧反响产生双乙酰。酿酒酵母可以产生复原酶，在酵母细胞内可以将双乙酰复原成乙偶姻，而后降解生成丁二醇，乙偶姻和丁二醇不会影响啤酒的品质。但由于啤酒的后酵期酵母含量很少，啤酒中的双乙酰复原速度很低，需要较长的时间才能够将啤酒中的双乙酰含量降至阈值之下，因而也会影响啤酒生产的周期。四2啤酒酿造中双乙酰的代谢调控根据酿酒酵母双乙酰的代谢途径。控制双乙酰的产生主要有以下几个策略，一是控制d一乙酰乳酸的生成量；二是提高旺一乙酰乳酸转化缬氨酸的效率；三是提高双乙酰的转化速度。通常
4、可以考虑在啤酒生产过程中的菌株选育和生产工艺两个方面入手，而当前的研究热点主要集中在菌株选育。21选育优良酵母茵株通过各种方法选育优良的酵母，是从根本上控制啤酒中双乙酰含量的方法。也是啤酒生产中最常用的方法。211定向驯化筛选双乙酰降解效率高的酵母菌株定向驯化技术即人为地施加外界压力使得微生物的进化朝着预期方向开展，是微生物筛选的一种最常用而又行之有效的试验方法。2111高浓度双乙酰定向驯化通过向培养基中添加高浓度的双乙酰，可以筛选得到双乙酰降解速度快的菌株，从而降低发酵液中双乙酰的含量。张秀丽等人161经过lo代的定向驯化，筛选得到优势酵母菌株，500mL三角瓶发酵实验结果说明，发酵液中双乙
5、酰含量与原始菌株相比下降363l，而其他的生物学特性仍与原始菌株保持一致。余晓红等吨通过双乙酰驯化培养，获得了双乙酰产量较低的优势酵母菌株。2112苯磺隆、甲磺隆定向驯化苯磺隆和甲磺隆(SM)均属于磺酰脲类除草剂，其作用机制是抑制植物a一乙酰乳酸合成酶(ALs)的活性，进而阻碍植物的缬氨酸(Val)与异亮氨酸(ne)生物合成。Faleo和Dumas fs研究发现，苯磺隆在酵母中的作用位点也是ALS。对SM抗性突变株进行遗传分析，发现SM抗性突变株的突变基因正是ALS合成基因的等位基因，这就使得SM抗性突变株可能产生活力较低的Ot一乙酰乳酸合成酶(A，因此可以通过筛选苯磺隆抗性突变株来获得产低双
6、乙酰酵母菌株。Gjtermansen C等09I的实验验证了该方法的可行性。方维明等ftol采用双乙酰结合苯磺隆的方法定向驯化得到低双乙酰啤酒酵母，双乙酰峰值为036mgL，发酵14d后双乙酰含量降至007008mgL。212诱变获得低产双乙酰酵母菌株采用诱变育种的手段结适宜宜的筛选方法筛选产低双乙酰酵母菌株是选育低产双乙酰酵母菌株的主要方法。目前主要集中在对诱变手段的研究，物理诱变采用的方法主要有紫外诱变、激光诱变和离子注入诱变等，化学诱变采用的方法主要有亚硝酸和EMS诱变等。申玉香等强过采用紫外诱变结合苯磺隆抗性筛选的方法选育得到产低双乙酰啤酒酵母，发酵试验结果说明与原始菌株相比筛选得到的
7、菌株发酵液双乙酰含量下降了53。汪志君等【12嗵过紫外诱变的方法筛选的得到一株啤酒酵母突变株，与原始菌株相比双乙酰的含量降低了20，高级醇的含量降低了30。张秀丽等ml以甲基磺酸乙酯(EMS)为诱变剂对啤酒生产菌株FB进行诱变，别离得到优良突变株BEZl 12，500L发酵罐的发酵试验结果说明，发酵8d后，BEZll2的发酵液双乙酰含量比FB发酵液中的含量降低了27。同时筛选得到一株产低双乙酰优势菌株FBE1，500mL三角瓶发酵试验结果说明，发酵8d后FBEl发酵液中双乙酰含量与原始菌株相比降低了427。张智维【t41等通过HeNe激光诱变的方法获得到一株产低双乙酰酵母突变株，发酵试验结果说
8、明，发酵7天后，发酵液中的双乙酰值为00836mgL，与原始菌相比下降了53。刘风珠等采用离子注入的方法对啤酒酵母进行诱变，结合双乙酰耐受筛选，获得优势酵母菌株，该菌株不仅酒精产量降低，而且双乙酰复原能力显著提高。213原生质体融合选育低双乙酰酵母菌株由于原生质体融合技术的优越性非常明显，因而在低双乙酰酿酒酵母的选育中也得到了广泛应用。蔡车国等日以发酵度较高、凝絮性较差的啤酒酵母菌株H38的原生质体为受体，以凝絮性较强、发酵度较低的啤酒酵母菌株Nl热灭活的原生质体为供体进行融合，获得融合子的发酵液中双乙酰含量均低于O07mgL，其它性状指标均优于亲本。王芬等117噪用双亲灭活的方法以啤酒酵母菌
9、株JWl一1和NW7-45为亲本进行原生质体融合。得到融合株DR92以120 Bx麦芽汁为培养基，用500L的发酵罐在12。C下发酵，发酵1ld发酵液的发酵度为695，发酵液中的双乙酰含量为00124mgL，该菌株在啤酒酿造工业中具有应用前景。周东坡等【18将生产用啤酒酵母LQl6和QSB7分别进行单倍体化，并筛选LQl6(Ile一，Datr)和QSB7(Ala一，H)的遗传标记，采用双亲灭活的方法进行原生质体融合，得到QSB2X16的Ot一乙酰乳酸合成的量与双乙酰生成的量均减少。214构建产低双乙酰的酵母基因工程菌株随着现代生物技术的开展，应用分子生物学方法构建工程菌株，是从根本上解决双乙酰
10、生成的最直接手段，也成为控制啤酒发酵液中双乙酰含量的首选手段。目前构建低双乙酰产生酵母工程菌株的途径主要有三个，一是在酿酒酵母中引入乙酰乳酸脱羧酶基因以改变俚一乙酰乳酸的代谢途径，进而降低双乙酰产量；二是弱化a一乙酰乳酸合成途径中合成酶系基因的表达以减少d一乙酰乳酸的合成；三是增强啤酒发酵过程中Q一乙酰乳酸的降解速率。2141引入乙酰乳酸脱羧酶基因研究说明乙酰乳酸脱羧酶可以促使Ot一乙酰乳酸直接快速生成乙偶姻，从而降低双乙酰的生成。Sone等f，91克隆产气肠杆菌的o【一乙酰乳酸脱羧酶基因，并在啤酒酵母中进行表达，发酵试验结果说明，转化后的菌株发酵液中的双乙酰含量不到受体菌株的25。Suihk
11、o等阿成功构建了含有克氏杆菌旺一乙酰乳酸脱羧酶基因的啤酒酵母工程菌株。张沛口-喏成功构建了含有食品级醋化醋杆菌的Gt一乙酰乳酸脱羧酶基因的啤酒酵母工程菌株，该工程菌株发酵液中双乙酰的量与受体菌株相比下降了13左右。2142减少a一乙酰乳酸的合成为了解决Ot一乙酰乳酸的合成和分解不平衡，可以选择弱化Ot一乙酰乳酸的合成。母茜等221用3一磷酸甘油酸激酶基因PGKI启动子和Ot-factor基因取代a一乙酰乳酸合成酶基因ILV2构建了工程菌株，在12d时乙偶姻含量降至40斗molL。ILV2基因的破坏，使AHAS酶活明显降低，使双乙酰合成减少，最终使得胞外乙偶姻的含量减少。刘喜风等阿将糖化酶基因(
12、GAI)引入酿酒酵母，同时去除PEP4基因，获得了低双乙酰酿酒酵母。张吉娜等【M嗵过自克隆的手段将酵母生产菌株YSF31中的ILV2基因替换成GSHl和CUPI基因构建低双乙酰酵母工程菌株，500raL三角瓶发酵试验结果说明，该工程菌株发酵液的谷胱甘肽含量比受体菌高34，而双乙酰含量比受体菌降低了25。王金晶等1251在酿酒酵母中引入糖化酶基因(GAL)和强启动子PGKl基因，同时去除乙酰乳酸合成酶基因(ILV2)和乙醇脱氢酶基因(ADH2)来降低双乙酰的合成2143加强a一乙酰乳酸的降解为了降低双乙酰的生成，可以考虑在啤酒发酵过程中加速俚一乙酰乳酸转化成缬氨酸，这样就不会形成双乙酰的累积。李
13、艳【笳等采用PCR技术扩增啤酒酵母QY中的羟酸复原异构酶基因ILV5，构建了整合载体YIp 5C，整合转化QY，通过铜抗性筛选转化子，所得的转化子的羟酸复原异构酶的活力明显高于对照菌株QY，转化子产生的双乙酰的量比原始菌株降低了40。22添加d一乙酰乳酸脱羧酶俚一乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)能够将q一乙酰乳酸直接分解成为乙偶姻，该过程中不存在双乙酰的形成过程。但是酵母菌本身并不存在ALDC，因此向发酵液中参加ALDC能够有效地降低发酵液中双乙酰的含量，已经广泛应用于啤酒的生产中。Godtfredsen等网从地衣芽孢杆菌中纯化了ALDC，并将其用于啤酒熟化的研究。发酵试验说明，添加ALDC后啤酒发
14、酵的成熟期大大缩短，仅需6d即可完成。23优化发酵工艺 酵母合成缬氨酸过程中产生的仅一乙酰乳酸是双乙酰形成的前体物质，在整个反响体系中，如果缬氨酸的含量增加，便会反响抑制一乙酰乳酸的形成，进而减少双乙酰的生成。在啤酒的发酵过程中提高麦芽汁中的d一氨基酸的含量可以提高缬氨酸的产量，能够在一定程度上地控制双乙酰的形成圆。仅一乙酰乳酸转化生成双乙酰是缓慢的非酶氧化过程，而双乙酰发生的复原反响的速度却很快，如果能够加速双乙酰的形成过程，便会有利于生成的双乙酰降解，最终降低双乙酰的含量。在麦汁冷却时向其中通入氧，以及发酵前期采用高温发酵都可以加速旺一乙酰乳酸向双乙酰的转化过程301。Mudura Ele
15、na等人13-1的研究说明生产中双乙酰含量受温度和温度变化速率的影响最大，而在后熟期双乙酰的含量下降速度会降低，因此应适当升高温度。Bekatorou等I北噪用低温固定化技术获得了较低的双乙酰产量。在发酵过程中施加压力可能影响酵母的相关代谢活力，进而能够影响到双乙酰的生物合成与复原，研究说明，1OMPa的压力条件下要比05MPa的在双乙酰的生成和复原速率都要低很多，调节麦芽汁渗透压也会影响双乙酰的产生。3展望当前降低双乙酰生成的方法主要是从菌株选育和生产工艺优化两个方面人手进行的。在菌株选育方面，传统的菌株驯化和诱变育种方法已得到广泛的应用。随着科学技术的不断开展，通过基因改造的方法构建工程菌株已成为一种直接而高效的手段，而自体克隆技术由于在DNA重组过程中不涉及到外源的基因，因此其平安性和性状稳定等方面的优势越来越受到研究人员的重视，必将成为今后工作和研究的热点。生产工艺方面的改变由于设备条件等方面的局限，效果不够明显。如果能够进一步深入了解双乙酰代谢相关过程的代谢途径和代谢机制，利用代谢工程和系统生物学的手段，从啤酒发酵生产的各个环节人手，采取适当的方法和措施，一定可以更加有效地控制发酵过程中双乙酰的含量，缩短啤酒的成熟期，减少啤酒的生产本钱，提高啤酒的质量。
