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1、 先进的液相色谱质谱联用的代谢显型专业：药物分析 学号：201413176 姓名：张旭关键词： 全球代谢轮廓 亲和色谱 液相色谱 质谱 代谢显型 代谢物组学 代谢组学 反相液相色谱 超高液相流动相 色谱法 超高液相色谱 摘要：我们回顾目前的分离技术应用于全球代谢轮廓和基于使用液相质谱联用。目前，大多数分离使用反相液相色谱法，不能很好的使用反相模式分离的极性化合物，亲和色谱是一个流行的选择。当超高液相色谱法快速、高效的样品分析的优点被发现后，逐渐代替了传统的高效液相色谱法在代谢方面的应用。我们讨论基于小型化的高效液相分离技术的选择性和新兴的样本轮廓方法，或者运用超临界高效液相和高效液相色谱分离。
2、前言：1、代谢产物使用生物标记来诊断和理解疾病、疾病机制，评价药物安全性和生理学（理解潜在生物化学）的基础研究不是最新的。为了发展代谢显型和利用高通量分析化学发展全球代谢产物轮廓，绝大部分目前在利用这些代谢产物先进的方法就是利用广泛轮廓方法学。此种类型的组学轮廓，通过它们支持者各方面了解作为代谢组学或者代谢物组学。代谢型的大多数目的是提供代谢产物相关浓度改变的信息，结果产生一种确定的生物化学状态以致于检测特殊条件下专属性的生物标记物（单独代谢物更经常为指纹）。理论上，这些标记物也应该提供新的视野在细胞上器官和整体生物体的生物学影响、生理学改变、疾病状态和治疗或毒性诊断。代谢显型的进程，在第一个
3、例子中基于假说和目标（理想的公平）测定方法。这些方法经常提供仅是相关测定并且目的在于尽可能检测和测定样本中的多种成分。目前，全球代谢轮廓使用高通量分析天平实现，例如核磁共振氢谱和质谱。后者可以被用于此轮廓通过直接注入样品或提取液或者结合使用色谱或电泳分离。（例如，气相色谱质谱联用，液相色谱质谱联用，超临界流体质谱联用或者毛细管电泳质谱联用）。作为全球代谢轮廓已经成熟并且成为系统生物学和生物标记的主流技术，一种新的挑战已经出现。然而发表对于流行病学和临床代谢显型综合的代谢物组学分析，就是这些技术包括的一直追求的可负担的、快速、高通量和高容量的方法。在这里，我们借助液相质谱联用技术研究目前代谢显型
4、的状况强调发展液相色谱分离。推荐精选2、 分离还是不分离？ 在基于质谱分析的基础上，一个减少全部复杂的分析系统的显而易见的方式就是排除分离步骤。质谱的能力就是基于质荷比分离粒子已经导致许多研究者推断这样的结果可能达到快速使用直接介绍的方法（直接注入），并且这种基于质荷比分离微粒是足够的，尤其是当使用高效质谱。并且，确实对于直接注入法有一种情况涉及速度和实现的容易程度（对于一些有趣的应用见例子10-12）。然而，在不知道样本无目标的分析情况下，这种问题有关于离子抑制和增强效应，并且很难区别在区域同分异构体和立体异构体和同素异形体等，限制了这种方法的价值。这种分离的优点对比更加广泛无靶标的代谢显型
5、的直接注入质谱的例子如图一，借助纳米光设备，比较大鼠血浆直接注入获得的光谱数据，这些数据来源于通过液相-质谱联用色谱图显示总结所有的数据。相同的四级杆飞行时间质谱分光仪在正离子电喷雾模式下应用于两个实验。从图一所列举的数据，有一些借助液相-质谱分析的重要的更多的离子检测比纳米喷雾注射是更清晰的。通过检测马尿酸盐和质荷比为297.1的峰在液相分析中两个大部分强度离子选择性检测的直接注入法是很突出显著的方法。 然而液相-质谱联用提供了一个更加广泛的轮廓，提高了生物标记物发现的潜能，一旦生物标记物被发现，它是清晰地可以使用直接注入法扫描。首先使用大气压固相分析探针（第一次描述被Mc.Ewan等人）借
6、助超高液相质谱联用定性，通过分析大鼠和狗胆汁来阐明这种方法。随着和是样品的准备，为了分解目前在胆汁中的微团，这种简单方法可以快速检测许多胆酸和辨别从大鼠和狗中得到的胆汁。已经有相关的例子，一个具体疾病轮廓，然后像这样一种方法，随着广泛轮廓首次实行为了确定显型和简单直接注入方法，对于随后的靶向分析可以提供一种途径来支持高通量扫描在临床试验的一个例子。推荐精选 逐渐增长的可利用的离子手性分离联合质谱可能改善代谢轮廓，借助包括一种十分快速分离步骤的直接注入方法提供，但仍然不可能去掉直接注入方法的所有的限制。见例子6，在大鼠血浆的初步的结果依旧表明这种方法在液相分离中的应用的优越性。然而，对于许多靶向
7、方法，合适有效的直接注入方法有明显的优势。3、结合方法 HPLC和它的变形技术代表目前主要分析技术用于代谢轮廓。 液相-质谱联用方法可能是快速的并且联合分离质谱提供极佳的，即使底物对于各种不同底物种类和物理化学特性是依赖的和灵敏的。液相-质谱联用可以使用的样品例如尿液、血清或血浆，经常是极小的样品准备或者依靠原始提取物或化学修正的形式根据气相-质谱分析的例子。自从20世纪末期，基于HPLC分析的应用结合电喷雾质谱已经形成了绝大多数文章应用于基于液相的代谢组学或代谢物组学，当超高效液相被引进这个领域在2005年之后，就开始逐渐被替代。 液相-质谱应用已经用于反相色谱分离，随着亲和色谱和离子对色谱
8、变得更加流行，由于反相液相色谱监测极性片断代谢物组学的局限性已经是显而易见了的。然而，当分析一个复杂的混合物，一个宽范围的极性分析物，没有一个理想的解决方法，因此，研究者被迫选择最好的方案使最大程度上包含样品中所有组分适于所使用的检测器。出于这个原因，绝大多数代谢显型实验已经使用反相液相色谱或者与亲和色谱或离子对色谱联合使用，描述如以下3.3部分中。推荐精选 3、1 UPLC-MS 同时在早期的研究中使用LC-MS来分析代谢组学和代谢物组学应用传统的HPLC（确实许多人依旧使用它），一步的改变基于挖掘LC-MS方法的代谢型潜力，发生在引进2m以下粒径的UPLC/UHPLC的方法。这种先进的兼容
9、性的技术与传统的HPLC对比如图2大鼠尿液中成分，借助HPLC和 UPLC分离。正如它显示的特点，UPLC是更加先进的代谢轮廓，结合随之而来提高的分辨率（每个峰分离的更准确），更高的灵敏度和效率，减少了离子抑制。这些特性已经使调查者能够显著的检测到在一样的样品中具有相同分析时间更多分析物的一个传统的HPLC的分离。 应用这种类型轮廓关于生物学问题一个早期例子就是使用UPLC-MS的方法描述尿液轮廓来源于三个家族的Zucker鼠表明家族的差异和一个重要的年龄轨迹如图三。 UPLC应用于代谢显型目前代表性“黄金标准”对于这种类型的分析物和此方法已经变得普通在代谢轮廓共同体的范围内对于研究人类疾病在
10、癌症调查、肥胖、酶诱发的易变性、肝和肾疾病中。Scopus的调查揭示在2009年，UHPLC或者UPLC术语变得同等的与HPLC术语，2013年，它被频繁的使用四次在文章中解决代谢组学和代谢物组学（此调查实行在2014年2月使以上术语在摘要、关键字和标题）。 利用UPLC对于代谢显型增长的可接受程度反映在最近公开的建议的标准方法（因此叫草案），描述了使用反相-超高效液相质谱分析样品，例如尿液、血清或血浆和组织。 一个主要的优点是2m以下的粒度的液相色谱是最佳分离发生在高线速度的流动相伴随着分离行为保持在持续一个宽范围的流速。UPLC宽范围的最佳流速允许高流速被用于产生非常快速分析，可以从一个使
11、用2-min反相梯度分离分析大鼠尿液的研究结果的例子中看出来。分析这种类型产生一种相似水平的显型的辨别一个传统的10minHPLC分离（虽然减少了在大量代谢产物检测的花费比10-min UPLC分析）并且清晰的提供在相同的时间范围的直接注入质谱的高通量分析的潜能，但也有减少离子抑制的优点。同时效率涉及仪器时间，这种类型的快速依旧导致大量溶剂消耗，现在已经逐渐成为一个严重的问题由于溶剂的购买和废液处置的费用，作为样品数量增加结合应用在流行病学和临床研究。溶剂可以被最少的使用借助降低内部柱子的直径，例如1mm，流速范围为150-250推荐精选L/min，相同线速度达到如传统的内径为2.1mm柱子。
12、这种方法的结果不仅增加了灵敏度和产率而且减少了溶剂的消耗。一个全面比较通过应用窄范围UPLC柱子达到的节约溶剂的文章最近已经发表并且推测出使用窄专控柱子导致减少4倍在溶剂的花费，同时提供增加了2-3.5倍测定灵敏度。同时这些透过粒子产生搞得效率，它们需要更高的柱压比传统的HPLC达到600L/min的流速结合使用2.1mm内径的柱子。一个可选择的方法应用基于非透过的2m以下的固定相，因此称为中心壳，柱子可以产生相似的效率，在这么低的压力下。对于代谢显型研究这一类方法的例子正出现在文献中如例子33 应用高分辨率的UPLC方法，例如以上的描述，结果使液相色谱峰宽在此基础上为要求的1-3s，因此它对
13、质谱检测器产生了一个重大的挑战。为了精确的定义色谱峰，它是必要的产生-12个数据点通过每个色谱峰，导致获得的速率在50ms范围内。然而，对于发展起来的高分辨率的质谱（200,000FWHM）傅里叶变换离子回旋共振质谱要求数据获得时间为1s，对于UPLC变得不切实际，当70F线性离子阱、四级杆离子阱和离子阱质谱被使用时，这个问题才被证实。与之同时，在代谢显型试验中渴望得到的质谱数据时，仪器责任周期问题可能导致这个问题。一种方法被Bateman等人描述来简化这个问题，应用可选择的高和低碰撞能快速获得，高分辨率ToF-MS仪，允许同时收集初级粒子和产物离子数据在一次获得中，这个仪器能够以20-spe
14、ctra/s获得数据，使它是适合对于高分辨率的液相色谱和已经用于许多代谢轮廓的应用。 3.2 高温UPLC 在LC中，最佳分离使用下的参数就是提高温度。事实上，由于缺少所需要温度的固定相，高温已经不被广泛使用。同时采用2m以下粒径LC导致很大的降低色谱峰宽度35m粒径用于HPLC，进一步改善可以通过高柱温实现。因此，高柱温可以减少流动相黏度允许在低压下操作，并且在分析物洗脱时可以推荐精选用来降低有机改性剂需要的比例（有时一起被消除）。 HT-LC可以在大量的模式下操作（例如，恒定温度但可以改变流动相组成借助溶剂梯度，或者恒定流动相组成结合一个温度梯度），并且，当如以上描述，对于代谢组学分析所有
15、方法使用的例子已经被阐述。使用提高UPLC柱温或者确实任何包裹柱子的LC分离，产生一个变化在Van Deemter Plot 中，改变最佳分离位置实现一个更高流速，尤其否认任何压力下降的优点，但是此方法被描述通过提高流速伴随着温度梯度以致于达到压力的要求。使用高柱温增加质谱发射效率，并不是线性增加对于所有分子，通过不能同分析物在柱子中迁移，可能导致灵敏度改变，如果需要的话提供其他方面的最佳选择条件。对于尿液中代谢轮廓使用HT-UPLC-MS恒定柱温，第一次在2005年阐明。在这个例子中，柱温为90推荐精选，流速为900L/min和操作压力为800bar导致峰更大空间分离比700bar溶剂线性梯度的条件下仅在10min。确实，随着分析时间变长(50min)，峰的分离空间容量大于1000也是可能的（如图4）在另一个例子，此时使用溶剂组成恒定（酸化溶液），温度梯度为50-180，用于家族Zucker 鼠尿液中显型的研究（二型糖尿病模型），然而，使用HT-UPLC分析血浆的方法是不成功的，并且它是清楚的洗脱非极性代谢产物，
