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1、实验二总 RNA 的提取和检测实验目的1.掌握从动物组织细胞中提取总RNA 的方法；2.熟悉紫外吸收法检测RNA 浓度与纯度的原理及测定方法；3.掌握 RNA 琼脂糖凝胶电泳方法并分析总RNA 的电泳图谱；实验原理（一）概述1. 10-5 g RNA/ 细胞含有 rRNA 80-85% ：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15%mRNA 1-5%2. mRNA 3 端存在 20-250 个多聚腺苷酸 (polyA) 结构，可用 oligo(dT) 亲和层析柱分离 mRNA 。3.RNA 分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍 -有机溶剂法，氯化锂 -尿素法，蛋白酶 K
2、- 细胞质 RNA 提取法、异硫氰酸胍 -酚-氯仿一步法等。4.目前常用的是Trizol 法。（二） Trizol 的主要成分1.Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂， 是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质， 其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。2.酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA 酶活性，因此Trizol 中还加入了 8-羟基喹啉、 -巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA 在上层水相中。4.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ；用乙
3、醇沉淀中间层可回收DNA 。( 三) 总 RNA的纯度检测原理：不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收， 光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。 RNA在 260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。因此，可以用 260nm波长分光测定 RNA浓度，OD值为 1 相当于大约 40g/mL 的单链 RNA。用 PH=7.6 的 TE（tris HCl 缓冲液）稀释 RNA样品 n 倍并以 TE为空白对照，根据此时读出的 OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度 : RNA (mg/mL) = 40 OD 260 读数稀释倍数 (n)/1000实验步骤（一）样品处理与Tri
4、zol 用量1.提取组织 RNA 时，每 50100mg 组织（即 0.5 0.5 0.5cm,约合 0.1cm3）用1ml Trizol 试剂对组织进行裂解；2.悬浮细胞先离心沉淀，每5-10 106 个细胞加 1mL Trizol 后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。3.培养贴壁细胞不须消化，可直接用 Trizol 进行消化、裂解， Trizol 体积按 10cm2/mL 比例加入。 (注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量 RNA 的前提；细胞数量与 Trizol 的比例，细胞的数量不能过多。 )（二）操作步骤1.细胞中加入 1 mLTrizol 用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后， 室温放置
5、 5min，使其充分裂解。（注意：此时可放入 -70长期保持）2.按 200 L 氯仿 /mL Trizol 加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-3min。(注意：此步一定要振荡混匀，使氯仿和Trizol 不分层 )3. 4 12,000g离心 5-10min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。 RNA 主要在水相中，水相体积约为所用 Trizol 试剂的 60。4.吸取上层水相，至另一新的离心管中。一般400-450 L 就足够了，千万不要贪多！（注：千万不要吸取中间界面）5.加入与水相等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4放置 5 min。7.412,000g 离
6、心 10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。8.加入 1 mL 75%乙醇，（在沉淀对面管壁加入，切勿触及沉淀！）盖紧盖子后，温和转离心管 1 周，充分润洗管壁。9.412,000g 离心 5 min，尽量弃上清。10.室温晾干或真空干燥5 min。（注： RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解）11.加入适量冰冷无RNase 的 PEPC 水（一般 10 -20 L），充分震荡混匀，瞬时离心，备用。（三）检测步骤1.将提取的 RNA ，按 1： 20 加入 TE 进行稀释2.稀释过后用分光光度仪进行检测，先使用TE 行进校对，空白对照，所有样品要先润洗三次之后，再加入50L 样液进行检测3.可直接显示 260nm 下的 OD 值以及， 260/280 的对比结果4.再将剩余未稀释的RNA 提取液，进行琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 的完整性（具体琼脂糖凝胶电泳操作步骤见实验三）结果与分析
