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1、攻读博（硕）士学位研究生论文课题开题报告书院（系、所） 教 研 室 专 业 中西医结合临床 研 究 方 向 中药复方逆转肝纤维化的实验研究 研究生姓名 导 师 姓 名 导 师 职 称 教 授 说 明一、本计划书由研究生本人与导师共同协商填写，要求字迹清楚，简明扼要，条理清晰。二、本表一式三份，一份留学科点，一份留二级学院，一份送研究生部备案。三、计划批准后非经同样手续不得随意更改。参加课题的研究生导师及指导小组成员姓名、职称、单位、签字：姓 名职 称工作单位（部门）签 字导师签名： 研究生签名： 年 月 日 年 月 日 1研究课题名称：软肝宁煎剂治疗大鼠肝纤维化的实验研究研究课题的目的：本研究
2、通过软肝宁煎剂对肝纤维化大鼠模型进行治疗旨在观察透明质酸（HA）的含量及肝组织中转化生长因子（TGF-1）和病理学方面的改变探讨中药复方软肝宁煎剂对肝纤维化的逆转作用。进一步揭示软肝宁煎剂的作用机理，并为临床筛选最佳治疗方案提供可靠依据。选题的理论和实际意义 肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏中胶原蛋白等细胞外基质（extracellluar matrix,ECM）的增生与降解失去平衡，进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程，轻者称为纤维化，重者进而使肝小叶结构改建、假小叶及结节形成，称为肝硬化。肝硬化致死人数仅次于肝硬化的人数仅次于恶
3、性肿瘤、心血管病、脑血管病和意外事故，居死亡原因第5位。现代医学认为肝纤维化是一个可逆转的病变，而肝硬化是不可逆转的病变。慢性肝病发展到肝硬化甚至腹水时则各种治疗难以奏效,西药又无特效药物,因此研究如何预防与治疗肝纤维化成为当今医学界的难题。中医学认为,本病的病机为多属嗜酒好醴或情志抑郁者 ,素常饮食不洁或常怀愤郁之气 ,正气内虚 ,外感“湿热毒邪”、“疫毒”、“蛊毒”等 ,外邪侵袭肝脏留而不去 ,阻滞肝经 ,肝脾不和 ,气血不畅 ,终致气滞血瘀 ,脉络失养 ,酿成瘀积之证。世界著名肝病专家Hans Popper曾说过：“谁能阻止或减慢肝纤维化的发生，将会治愈大多数慢性肝病患者”。因此如何逆转
4、肝纤维化成为近年科学研究的重点，中医药抗纤维化更是研究的热点。 2国内外研究情况简介：肝纤维化 (hepatic fibrosis)是由多种原因造成肝脏损伤 ,首先启动炎性细胞 ,导致肝星状细胞 (HSC)激活、增生、转化和分裂 ,继而引起肝内细胞外基质 (ECM)过度沉积与增生。在肝纤维化时,、 型胶原大量积聚 ,广泛分布于肝间质 ,病理特征为汇管区纤维结缔组织增多 ,形成细小的条索与菲薄的间隔 ,由汇管区向小叶内延伸 ,但无假小叶与再生结节形成。此时肝内胶原的含量较正常时增加 4倍7倍,其实此种改变在肝损伤的早期即已出现。一般认为,肝纤维化的形成过程主要取决于胶原的合成、沉积与降解和吸收的
5、动态平衡 ,当胶原合成与沉积大于降解与吸收时则肝内胶原纤维增加,逐渐形成肝纤维化1。肝纤维化持续发展的中心环节在于肝细胞损伤时对周围非实质细胞的不断刺激 ,导致 ECM的大量合成与沉积 ,从而引起肝组织结构的破坏与改建 2。并且 ,免疫介质对细胞间质尤其是胶原蛋白的代谢有重要的调节作用 ,其中转化生长因子、IL-11、肿瘤坏死因子等的作用尤为重要 ,这些细胞因子既损伤肝细胞 ,又刺激成纤维细胞增殖及生成大量胶原 3。HA产生于肝星状细胞,在内皮细胞中降解,肝纤维化时产生增加。肝纤维化时，内皮细胞受体减少，摄取降解HA减少,加之HA通过侧枝分流进入体循环,因而血中HA水平增高,血清水平是判定肝纤
6、维化活动最敏感的指标4。转化生长因子（TGF-1）在肝纤维化中的作用可以概括为：刺激PG和FN合成与分泌；降低ECM蛋白酶的活化、胶原酶的活性和PG的降解；提高血小板衍化生长因子（PDGF）mRNA和细胞粘附受体的表达；使成纤维细胞和血内单核细胞发生趋化作用5。祖国医学无“肝纤维化”一词 ,据其临床症状、体征及病理特征可归属于“胁痛”、“积聚”、“瘕”、“臌胀”等范畴。其病因病机多属嗜酒好醴或情志抑郁者 ,素常饮食不洁或常怀愤郁之气 ,正气内虚 ,外感“湿热毒邪”、“疫毒”、“蛊毒”等 ,外邪侵袭肝脏留而不去 ,阻滞肝经 ,肝脾不和 ,气血不畅 ,终致气滞血瘀 ,脉络失养 ,酿成瘀积之证。对其
7、病机的认识,但大多数认为瘀血是肝纤维化的基本病机。中医药抗肝纤维化的机制主要包括：中药抗纤维化机制有：保护肝细胞，清除肝纤维化的诱发因素，抗脂质过氧化，减轻肝细胞损害及其脂肪变性，同时中药有较强的活血化瘀功效。抑制HSC 的活化增殖，中药复方能较好地抑制 HSC 的活化增殖及活化的 HSC 合成分泌胶原的能力，抑制传代大鼠 HSC 的增殖及强刺激因子 PDGF-bb 诱导的 HSC 的增殖，并且抑制传代 HSC 的胶原生成率及其、型胶原的表达，其中对型胶原表达的抑制最强。抑制转化生长因子-(TGF-)的分泌及其活性，TGF-是促肝纤维化形成最重要的细胞因子，它不但间接地引起 HSC 的活化增殖
8、，而且诱导 HSC 分泌过量的 ECM。中药复方能减少肝组织 TGF-1 的分泌量及其、型受体的表达量，还可直接抑制 HSC 分泌 TGF-1。促进 ECM 的降解，生理情况下，ECM 处于动态的生成和降解的代谢平衡中。肝纤维化发生时，这种平衡被打破，细胞外基质不仅在数量上大大增加，沉积于肝脏，而且发生组分的改变或重构。金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)表达增加是肝纤维化过程中胶原降解减少的主要原因，中药复方可降低肝纤维化大鼠模型的肝组织中 TIMP-1mRNA 表达等6。 参考文献：1.程明亮 ,杨长青 .肝纤维化的基础研究与临床 M.第 2版 .北京 :人民卫生出版社 ,2 0 0
9、2 ；92. Shinizu I. Sho-saiko-to. Japanness herbal medicine for protection against hepatic fibrosis and carcinoma J. JGastroenterol Hepatol,2 0 0 0 ,15(suppl):D84- 903. Flisiak R. Cytokines in the pathogenesis of liver fibrosisJ Przegl Lek,1999,56 (9):604-6074. 孔宪涛.肝纤维化诊断指标及其评估.中华肝脏病杂志,1998,6(4):2435.
10、程明亮 ,杨长青 .肝纤维化的基础研究与临床 M.第 2版 .北京 :人民卫生出版社 ,2002 ；9：576车颖，徐婷婷，姜妙娜，等. 中药肝复康抗大鼠肝纤维化的实验研究.中国中药杂志，2004，6： 3主要研究内容： 1. 建立模型 给大鼠腹腔注射40CCL4橄榄油溶液，首剂量为5.0 mlkg体重，以后每周注射2次，每次剂量3.0mlkg体重，持续6周，每周测量大鼠重量，调整四氯化碳剂量。造模开始2周给予高脂、低蛋白质复合饲料(猪油20十胆固醇0.5十玉米粉79.5)，2周后改用普通饲料，6周造模期间用10白酒作为唯一饮料。（张万国; 胡晋红. 桑黄预防大鼠肝纤维化作用的实验研究. 药学
11、服务与研究 2002.06.15; 2(2): 82-84）2. 观察指标 实验动物一般情况 :体重、毛发、活动、摄食等情况及病死率。 应用光学显微镜观察HE染色后切片，观察肝纤维化的程度。 肝指数：肝脏重量/大鼠体重 观察其肝脏纤维化样变化情况 以放射免疫方法检测大老鼠血清中透明质酸（HA）的含量； 免疫组化法检测肝组织中TGF1。 4主要研究方法（临床或实验设计）及主要技术路线： 1. 实验对象 Wistar大鼠（清洁级、雌雄各半、体重180200g）50只。2. 分组 采用随机方式进行分组 A组7正常对照组（n10）， B组肝纤维化模型组(n=10),C组软肝宁预防组 (n=10),D组
12、软肝宁高剂量治疗组(n=10)，E组软肝宁低剂量治疗组（n10）。3.方法 动物分组及模型制备雄性Witar大鼠,体重180200g,随机分为8组:正常对照组(简称正常组)、病理模型对照组(简称病模组)、软肝宁预防组(简称软预组)、软肝宁高剂量治疗组(简称软高组)、软肝灵低剂量治疗组(简称软低组),每组10只。除正常对照组外,其余各组均复制肝纤维化模型，给大鼠腹腔注射40%CCl4橄榄油溶液，首剂量按体重计算为0.5ml/l00g，以后每周2次，每次剂量为0.3m1100g，持续6周，每周测量大鼠重量，调整四氯化碳剂量。造模开始2周给予高脂低蛋白复合饲料(猪油20十胆固醇0.5十玉米粉79.5
13、)，2周后改用普通饲料。6周造模期间用10乙醇作为唯一饮料。同时为维持病因刺激，每周仍注射1次40CCl4橄榄油溶液，剂量为0.3m1100g，持续4周。整个实验过程为10周。给药方法预防组于造模同时给药,1次/日,每天下午6时灌胃,连续10w;治疗组于造模第7w给药,方法同预防组,至第10w末结束。用药剂量为:软肝宁预防组和软肝灵高剂量组2ml/100g,软肝灵低剂量组1ml/100g。病模组和正常组给予自来水2ml/100g灌胃。4.标本留取与指标检测末次给药24小时后大鼠称重后 ,眼眶取血 ,离心取血清备用。用日立全自动生化仪检测肝功能。放免法检测大鼠血清中HA含量处死大鼠 ,解剖 ,取肝脏迅速用天平称重 ,并计算肝指数；将称重后的肝脏右叶固定于10%福尔马林溶液中 ,作苏木素 -伊红染色及胶原纤维染色 ,显微镜下观察其肝脏纤维化样变化情况。取肝左叶用免疫组化方法检测肝组织TGF1。5.数据处理 SPSS统计软件12.0版本， t检验。 5研究进度及具体时间安排：
