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1、实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的建立及其病理学和影像学表现【摘要】 目的： 建立实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠模型并做病理学及影像学鉴定，为研究多发性硬化的发病机制奠定基础。方法： C57BL/6雌性小鼠80只，分为EAE 1组、EAE 2组、EAE 3组、EAE 4组，各15只，用MOG35-55抗原加完全弗氏佐剂不同注射方法制作EAE小鼠模型；佐剂组10只用生理盐水代替MOG3555制备免疫乳剂，对照组10只仅注射生理盐水；用MRI对小鼠脑和脊髓进行扫描，HE、LFB染色和Bielschowsky
2、s银染观察小鼠脑和脊髓病理学改变。结果： 免疫后第14天，EAE 1组、EAE 2组、EAE 3组、EAE 4组小鼠开始出现EAE临床症状，发病率分别为80%、80%、73%、67%；EAE 2组、EAE 3组小鼠临床症状评分与EAE 1组比较，P，EAE 4组小鼠临床症状评分与EAE 1组比较，P；佐剂组与对照组小鼠均未出现临床神经系统症状；EAE小鼠脑和脊髓小血管周围炎细胞浸润呈袖套状或脱髓鞘改变，神经元变性及轴突损伤，MRI可显示脑和脊髓病灶。结论： 应用背部、颈部、腋窝、蹊部多点注射可提高EAE发病率，1次免疫与两次免疫小鼠对EAE发病率的影响没有明显差别。【关键词】 脑脊髓炎； 脑；
3、 脊髓； 神经元； 磁共振成像； 小鼠Abstract Objective: To establish autoimmune encephalomyelitis (AE) mouse model and observe its pathological and imaging appearance, and so as to provide a basis for study of pathological mechanism and therapy of multiple sclerosis. Methods: Eighty C57BL/6 female mice were divided
4、randomly into 6 groups, with 15 in each of groups of EAE1, EAE2, EAE3, and EAE4. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) were induced in mice of the 4 groups with 300g of MOG35-55 plus complete Freunds adjuvant (CFA) by different methods. Mice in adjuvant group (group ADJ, n=10) were treated
5、 with CFA plus normal saline, while mice in control group (group CON, n=10) treated with normal saline only. MRI examination and pathological observation on the brain and spinal cord were carried out on mice in groups of EAE1, ADJ, and CON. Methods used in pathological observation included HE staini
6、ng, Luxol Fast Blue staining, and Bieschowsky silver staining. Results: Clinical symptoms of EAE appeared in mice of groups EAE1, EAE2, EAE3, and EAE4 in 14 days after immunization, and the incidences were 80%, 80%, 73%, and 67% respectively. Clinical symptom scores of groups EAE2 and EAE3 were not
7、statistically different from that of group EAE1(P), while that of group EAE4 had statistically significant difference from that of group EAE1(P). No obvious EAE symptom was found in groups ADJ or CON. Pathological observation showed inflammatory cuff around small blood vessels, demyelization,degener
8、ation of neurons, and axonal injury in brain and spinal cord of mice in EAE groups. Foci of disease in brain and spinal cord were showed by MRI. Conclusions: Multipoint injection at back, neck, armpit, and groin could increase the incidence of EAE. Twice injection of reagent does not make significan
9、t difference from one single injection in the incidence of EAE.Key words encephalomyelitis; brain; spinal cord; neurons; magnetic resonance imaging; mice 多发性硬化是一种主要累及中枢神经系统的炎症性、多发性的脱髓鞘自身免疫性疾病，具有症状复杂多变、缓解与复发交替进行、病程迁延不规律等特点，迄今尚未完全明确其病因和发病机制1，也没有特效的治疗方法。实验性自身免疫性脑脊髓炎是一种由活化T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，主要病理特征为血管周围炎
10、性细胞浸润和神经脱髓鞘反应，在临床症状、生化指标及病理等方面与MS具有相似的特征，因此EAE被认为是研究MS的良好动物模型。2009年3月2009年7月，参照国内外文献报道的方法2，3，以完全弗氏佐剂与MOG35-55制备的乳化抗原，辅以腹腔注射百日咳毒素，成功建立了C57BL/6小鼠的EAE模型，通过病理学和影像学鉴定该模型的可靠性，为进一步研究MS的发病机制和治疗方法奠定动物模型基础。1 材料与方法主要试剂MOG3555多肽MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK购自西安美联多肽合成有限公司，纯度97%，-20 保存备用；国产百日咳毒素由成都生物制品研究所馈赠，卡介苗购自中国药品生物制品
11、检定所；进口百日咳毒素、Luxol fast blue、焦油紫、完全弗氏佐剂、硝酸银均购自美国Sigma公司；结核杆菌H37Ra购自美国Difco公司，重铬酸钾、碳酸锂、伊红等化学试剂购自恒因生物有限公司。实验动物及分组雌性C57BL/6小鼠80只，48周龄，体质量1520 g，购自重庆医科大学动物室。按照随机对照分组的原则将小鼠分为6组：EAE 1组、EAE 2组、EAE 3组和EAE 4组，每组15只，佐剂组和对照组各10只。EAE模型制备用 mol/L的PBS将MOG35-55稀释成300 mg/L，然后将稀释液与等量的完全弗氏佐剂(卡介苗的终浓度为10 g/L或结核杆菌H37Ra终浓度
12、为5 g/L)混合，用玻璃注射器抽打至油包水状态，制成诱导EAE的抗原乳剂。佐剂组则以生理盐水代替抗原肽制备免疫乳剂，对照组仅注射生理盐水。EAE 1组、EAE 2组小鼠分别于背部、颈部、腋窝、蹊部4点皮下注射相应抗原(卡介苗的终浓度为10 g/L) ml/只，EAE 4组小鼠于背部四点皮下注射相应抗原(卡介苗的终浓度为10 g/L) ml/只，EAE 3组小鼠分别于背部、颈部、腋窝、蹊部4点皮下注射相应抗原 ml/只，免疫当天为第0天。于第0、2天给予EAE 1组、EAE 2组、EAE 4组和佐剂组小鼠腹腔注射国产百日咳毒素 mg/只，给予EAE 3组注射进口百日咳毒素 mg/只。于第7天给
13、予EAE 2组小鼠再次于背部、颈部、腋窝、蹊部4点皮下注射相应抗原(卡介苗的终浓度为10 g/L) ml/只。体重监测及神经功能评分第0天开始，每日称体重，观察小鼠的摄食情况，并采用双盲法每天两次进行神经功能评分，评分标准为通用的05级评分法：0级，不发病；1级，小鼠尾部张力降低或麻痹；2级，小鼠尾部麻痹，后肢无力；3级，小鼠后肢瘫痪；4级，小鼠四肢瘫痪，人为翻身不能复位；5级，濒死状态或发病后死亡。组织取材与影像学、病理学检查小鼠发病后第3天，EAE 1组、佐剂组、对照组分别取5只小鼠予10%水合氯醛麻醉后放在柔性线圈中间行常规脑和脊髓MRI检查。影像学检查后将动物断颈处死，立即在无菌条件下
14、取出脑；一次性20 ml无菌注射器用灭菌生理盐水冲出完整的脊髓，其中部分立即浸入4%多聚甲醛液中固定1224 h，冰冻切片，同一部位5 m切片行HE染色和30 m切片用常规方法行Luxol Fast Blue染色；另一部分用常规方法行Bielschowskys银染。在光镜下观察炎性细胞浸润、脱髓鞘改变及轴突损伤。统计学方法计量资料均以表示，采用SPSS 统计软件进行数据分析，组间比较采用F检验及t检验，为差异具有显着性意义。2 结果临床表现免疫后每天对小鼠进行临床评分，EAE1组、EAE2组、EAE3组、EAE4组小鼠免疫后第1419天开始陆续发病，发病前毛色发暗，活动减少，食欲较差，反应迟钝
15、，发病率为80%、80%、73%、67%。首发症状多为尾部远端无力下垂，体重明显减轻，临床评分随着时间延长加重，第1822天为高峰，表现为尾部完全松弛无力，蹒跚步态，后肢或四肢瘫痪，人为翻身不能及不能站立等。发病高峰过后，EAE小鼠的体重逐渐恢复，症状有所缓解，但直至第35天仍有部分小鼠遗留有尾部拖垂的症状。EAE2组、EAE3组小鼠临床症状评分与EAE1组比较，P。EAE4组小鼠临床症状评分与EAE1组比较，P。佐剂组和对照组均未出现临床神经系统症状(表1)。表1 各组临床表现比较注：(1)与EAE 1组比较；(2)与EAE 1组比较。脑和脊髓病理学改变佐剂组和对照组小鼠的脑和脊髓HE、LF
16、B染色和Bielschowskys银染均未发现明显异常改变。EAE 1组小鼠发病第3天HE染色可见脑干、小脑、大脑和脊髓白质区内有不同程度的炎性细胞浸润，以脊髓、脑干最常见，多见于小血管旁，呈血管袖套样改变；神经细胞肿胀、变性、坏死；大脑皮质下的白质区可见散在胶质细胞聚集及胶质小结形成，甚至能看见噬神经现象。LFB染色可见在脑和脊髓白质中有大小不等的片状髓鞘脱失区。Bielschowskys银染可见脑和脊髓有轴突呈节段性损伤。MRI扫描佐剂组和对照组小鼠脑和脊髓MRI扫描均未发现明显病灶。EAE1组小鼠发病第3天行脑和脊髓冠状位(图4A)与轴位百日咳毒素和卡介苗是免疫原性的佐剂，实验中发现，同等浓度的国产百日咳毒素、卡介苗用量需是进口百日咳毒素和H37RA结核分枝杆菌的两倍才能有效免疫动物，应用国产试剂价格便宜，只要把握好剂量同样能
