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1、实验十、大肠杆菌感受态细胞的制备【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.20.4时,用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞, 细胞膨胀成球形,可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态(感受态),处于此状 态的细胞称为感受态细胞(competent cells)。【器材与试剂】1. 实验仪器培养箱,恒温摇床,超净工作台,低温台式离心机,分光光度计,水浴锅,高 压灭菌锅,微孔滤器(含0.22pm滤膜),酒精灯2. 实验试剂氯化钠,无水CaCl2,蛋白胨,酵母提取物,1.0 mol/L NaOH,氨苄青霉
2、素钠, 琼脂粉,LB液体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl10 g,800 mL蒸馏水溶解后, 用NaOH溶液调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL,121C高压灭菌20 min;LB固体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl10 g,800 mL蒸馏水溶解后,用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL,然后加入琼脂粉15 g,121C高压灭菌20min, 分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基,当温度降至60C左右时,加入1 mL氨苄青霉 素溶液(100mg/mL),混匀,分别倒入无菌培养皿;CaCl2溶液:准确称取无水氯化钙
3、11.1 g, 用双蒸水溶解,并定容至1 000 mL,121C高压灭菌20 min,4C保存;氨苄青霉素钠溶液: 准确称取氨苄青霉素钠0.5 g,用蒸馏水溶解并定容至5 mL,用微孔滤器过滤除菌后,分装 于Eppendorf管中,-20 C保存。3. 实验材料E.colDH5a, pUC18质粒【实验步骤】1 .接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中,37C振荡(约250r/min)培养过夜。2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中,37C继续 振荡培养至OD600约为0.20.4 (约2 h)。3. 取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf管中,冰浴放置1030 min, 4C, 1500Xg离心 5 min,弃上清。4. 沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮,冰浴放置15 min,4C,1 500Xg离心5 min, 弃上清。5. 沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮,放置在冰浴中,制成大肠杆菌感受态细胞。 注意事项1. 应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞,OD600最好不超过0.4。2. 整个实验最好在低温环境下进行,以获得较高的转化效率。3. 每次悬浮沉淀细胞要轻缓,避免剧烈振荡。【实验结果】