酶化醇解在燃料制造和油处理中的应用

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1、酶化醇解在燃料制造和油处理中的应用摘要生物燃料（脂肪酸甲酯FAMEs）能够把废弃的含有一个脂酶的食用油采用甲基化生产制得， 迄今为止被报道的是在反应系统中甲基化程度过低，而且无酶活性脂酶催化剂不能够被重复 使用。我们需要澄清的问题是，不溶于甲醇的原因是脂酶的钝性不能被活化。基于这一结果， 我们使用不活动的假丝酵母属脂酶逐步发展成为甲基化体系。全部甲基化是对来自于废弃油 的生物燃料生产中最有效的部分，此过程可分为两步：第一步反应，处理 1/3 摩尔质量甲醇 的化学数量，第二步反应是，通过增加 2/3 摩尔质量甲醇来反应。如果无活性的输送物被一 个推动反应的搅动破坏，第三步反应将会发生作用：第一步

2、的基体是废弃油和 1/3 摩尔等量 的甲醇，第二步是第一步的流出液和 1/3 摩尔等量的甲醇，反应第三步是第二步的流出液和 1/3 摩尔等量的甲醇，反应在两个反应体系中废弃油转化为生物燃料的转化率大于90%，而且 脂酶催化剂在一百天之内活性不会消失，这种步骤化的醇解可以被成功应用于金枪鱼油的醇 解。1 介绍环境污染意识的增强引发了零放射物的构思和废弃食用油的全部回收利用的想法，作为一 个世界范围的社会问题引起相当的注意。在日本，每年排出 400000t 废气食用油，估计有一 半用作动物饲料润湿油和喷漆，剩下的则被排入环境中。因此，从废弃使用油中制取生物燃 料（脂肪酸甲酯FAMEs）被认为是减少

3、和重新回收废弃油的重要一步。在这一方面，日本的几 个当地政府开始从家庭中收集使用过的废弃油并且将其转化为供应公共交通的生物能源。目前，工业生产生物燃料通过碱性催化剂甲基化废弃油来实现。产物中包括副产物、甘油、 碱性催化剂、处理过后的废弃油等。由此可见，产生的碱水对环境产生的多方面影响，而在 脂酶催化反应中，废弃油的酶化醇解不产生废弃物，所以用脂酶来制造生物燃料成为一种必 然需求。2 迄今为止有关酶化醇解的报道脂酶不仅被用来水解，而且被用在非水介质酯化作用中，脂酶的甘油三酯的 甲基化被认为是从废弃食用油中提取生物燃料的一个最有效的方法。在我们开始研究酶化生 物燃料的生产之前，酶化醇解的方法已经被

4、报道。对于含 20水分的长链脂肪醇，使用无活性的 Rhizopus delemar 和 Rhizomucor miehei 的脂肪催化醇解。因为脂酶对多不饱和脂肪酸的作用弱，金枪鱼油和月桂醇反应中提出的醇 化脂肪酸乙酯，除了多不饱和脂肪酸乙酯转化，还使得乙酯部分含有丰富的(PAFAEE)。鱼油 的乙醇分解也使其富含多不饱和脂肪酸。当沙丁鱼和金枪鱼油使用了自由的假单细胞细菌脂 肪酶的乙醇，经过一定化学计量的醇化的之后，脂肪酸(除了多不饱和脂肪酸以外)转化成 乙脂。因此，在甘油脂部分富含二十二碳六烯酸(DHA)和eicosapentaenoic acid (EPA)。除了上述的醇解外，非选择性的甘

5、油三酯甲基化也被报道。非活性的假丝酵母属酯酶和 1.7摩尔等量乙醇被用来醇化多不饱和脂肪酸油。因为这种酯酶和饱和脂肪酸对多不饱和脂肪 酸的作用一样强，油被转化到对应的脂肪酸乙脂上，既使多不饱和脂肪酸中弱活性的脂酶能 够有效的醇解鱼油，如果反应在一个有机溶剂中发生，在正己烷试剂中使用固定的 R.miemei 脂酶将沙丁鱼和金枪鱼油中加入1.3摩尔等量的乙醇醇解，将使90的鱼油转化为醇化脂肪 酸乙脂。尼尔森et al.首先将甲基甘油三酯的酶化醇解作为生产生物燃料的最终产物。在正己烷 试剂中，当油和脂肪的醇化与甲醇、乙醇用固定的 R.miehei 脂酶，则 95的甲基甘油三酯 将转化成为对应的甲(乙

6、)酯。在缺乏有机溶剂的条件下，即使在相似条件中，牛脂甲醇分 解的产量只有65。同时，如将长链醇在有机自由溶剂系统中作为基体则可增加牛脂的醇化， 加入异丙醇反应中可达到90的转化率，而加入异丁醇和2丁醇则可达到95%的转化率。除 此之外，据报道，加入甲醇、乙脂固定的 C.antarctica 脂酶适合作为醇化甲基甘油三酯的催 化剂。先前的报道可以被总结如下：(1)加入长链脂肪醇的脂酶醇解的甲基甘油三脂的效率要 高于加入甲醇、乙醇的效率。(2)在有机溶剂中使用甲醇、乙醇的醇解甲基甘油三酯的效率 要高于不使用有机溶剂的。(3)虽然固定的脂酶被用来作为催化剂，但是酶制剂却不能重复 使用，一个有机溶剂系

7、统并不适合从废弃油中生产生物燃料，因为存在着爆炸危险和溶液更 换的难度。因此，我们的目标就是发展一个无溶剂系统，可以保证甲基甘油三酯的转化率大 于 90。并且催化酶可以长时间使用。3 生物燃料的酶制法3.1 不能溶解于甲醇的脂酶的失活大体上，当基体彼此互溶，脂酶具有效催化能力。我们第一个实验是调查菜油中脂肪醇的溶解性（一个大豆和油菜籽油的混合油）。含碳个数大于3 的脂肪醇，在一个化学质量单位 的脂肪醇能完全溶解于油，而在甲醇和乙醇中的溶解性分别为 1/2、1/3。不可忽略的溶解性，至今的报道中单位化学质量醇化甲基甘油三酯大于单位化学质量的甲醇或乙醇。我们现在意 识到蛋白质基本上不能在短帘解率过

8、低C.antarCti加大于1/2 储在尊/3摩尔等量的甲醇中，在与不溶于油的通过与油虫中存在不溶的甲醇相1/3摩尔等量的、ica】摩尔等量的甲醇，则甲醇分解明显I甲醇和乙醇，因此我们假设，甲醇（乙醇）分 I接触导致脂酶失活。事实上，使用固定的 甲醇完全消耗在甲醇分解的菜油中，但是通过添 咸少（如图1）。除此以外，所减少的活性不能存 甲醇接触中将导致固定脂酶发生不可逆性失活。4000.5115Metha noirfatty acid (moie/mole)0*inonTtn【當】 UQ笆AUQQQ | uIII、I01020304060Reaction time (h)图 23.2 菜籽油的甲

9、醇分解的步骤由甲醇转化的相应的脂肪酸甲脂，固定 C.antarctica 脂酶的情况下，一个单位化学质量 的甲醇能完成反应生成生物燃料由甘油三酸酯转化。然而，通过加入大于 1/3摩尔等量质量的 甲醇会使其活性丧失，并且甲基化停止。因此，我们试图将甲基化的菜油分三步加入 1/3摩尔 等量的甲醇。第一步，甲基化是在30C混合油、1/3摩尔等质量的甲醇和4%的固定脂酶的混 合反应， 7个小时后油的转化率达到33.1，紧接下来的第二个步骤1/3摩尔等量甲醇可使转 化率在10小时后达到66.4%，第三个步骤是1/3摩尔等量的甲醇被加入后，需要24小时，并 且反应继续（总共48小时），转化率可以达到97.

10、3%（如图 2）。经过这三步的甲基化被有效并 且近似将油完全转化。在甘油三酸酯中甲醇的溶解度很低，但是甲醇在脂肪酸甲酯中的溶解度很高。第一步反应 可以加入甘油脂，33的脂肪酸甲酯和 2/3 摩尔质量的甲醇，防止全部脂肪酸被混合反应全部 溶解，发现在混合甘油酯、脂肪酸甲酯和一定质量甲酯混合液中，固定脂酶的活性不失活。这 个发现直接使得甘油三酸酯的两步甲基化取得成功。图 2 显示了一个典型的时间过程，第一步 甲基化在混合油中开始是在30C, 1/3摩尔等量的甲醇和4wt%固定脂酶，在这种情况下，转 化率可以7小时达到33.2，然后在第10小时时加入剩下2/3摩尔质量的甲醇油转化为相应 脂肪酸甲酯转

11、化率可以达到96.8%（总共34小时）。通过调查，对稳定的有活性脂酶进行准备，二步和三步甲基化被重复进行，三步甲基化的 步骤如下：第一步反应是发生在30C的菜油，1/3摩尔质量的甲醇和4wt%的固定脂酶组成的 混合液中。第二个和第三个1/3摩尔质量甲醇别在第10小时和第24小时时添加，并且第三步 反应需要继续进行24小时（总共48小时）。同时，两步甲基化反应和三步甲基化反应是在许多 相同条件下进行的。在12小时时添加2/3摩尔质量的甲醇，这个反应还要继续24个小时（总 共36小时）。这两个反应后的脂酶再转移到第一步反应中的油或甲醇混和液中循环利用，超过 95%的转变在三步骤甲基化反应中需经历5

12、2个周期（104天）或者在两步骤甲基化反应70个 周期405天，这剩下的甘油酯并非全部转化为甲基甘油三酯，而是一部分转化。除此之外,FFA 含量少于0.25%。结论是同时水解过程可以忽略。这些结果指出 C.antarctica 脂酶能够使用 100多天并且不明显失活。除此以外，在相同的可耐性条件下两部甲基化生产率增加了25%。3.3 甲醇分解作用下蔬菜油的流动性当生物燃料在工业生产中通过两步反应得到，一个反应者被用作推动者。然而，在一个较 长时间内，使酶载体分解的物资力量被允许在固定的酶中使用。因此，我们试图使用一个两步 的连续流动性反应作用于固定的C.antaretica脂酶。这种脂酶和植物

13、油、1/3摩尔质量的甲醇 混合不会被钝化，但是与第一步的流出液和2/3摩尔质量的甲醇混合会产生明显的钝化。如先 前所做，在第二步反应中，添加的2/3摩尔质量甲醇不能使脂酶失活。这种差异或许可以通过 甲醇分解作用和甘油的副产物的影响来解释。因为它的高黏质相当于许多甘油停留在反应的底 部。甘油扰乱了脂酶分子，并且在反应效率反方面逐渐减少，不反应的甲醇却逐渐增多。甲醇 通过反应转移到了甘油层，并且甲醇在甘油层中的高聚集还引起脂酶的失活。同时，在两步反 应中，一定量的甲醇被混合后，被固定的载体覆盖在甘油上。因此，两步反应的脂酶不能被甲 醇钝化。因为在低浓度的甲醇中 C.antarctica 脂酶不能被

14、钝化，我们试图通过三步骤的菜籽油甲酯 分解作用来实现，这个反应在30C的（15mmX80mm）的反应器中加入3g的固定酶反应，菜籽 油和1/3摩尔等量的甲醇混合物以持续的流速（60mol/h）进入第一反应器内（33%转变）流出 液被允许除去甘油，第二个1/3摩尔质量的甲醇被添加到甘油流出液，并且混合物被以固定的 流速（6.0mol/h，转化60%）混合到第二反应器。最后一步在甘油流出液和1/3摩尔等量的甲 醇中反应流速为（转化， 93%）。这三步反应持续100天，但是脂酶活性几乎没有减弱。最后的 产物脂肪酸甘油甲酯的流速略低于前面一系列的反应，但是FFA的含量仅为0.2%，这剩下的 主要部分是

15、乙酸甘油。这些结果显示固定的C.antaretica脂酶并不仅仅在第一步中有较高的效 率而且在第三步中有较高的效率。3.4 从废弃的食用油中生产生物燃料 我们的目标是通过酶化使废弃食用油转化为生物燃料，因为有步骤地醇解能有效的使菜籽 油转化为其相应的FAMEs,我们的下一个目标就是从废弃食用油中生产生物燃料。3.4.1 在废弃油的甲醇分解作用中水的作用 新鲜的菜籽油和废弃的菜籽油之间最主要的差异就在于其中水分和自由脂肪酸含量的不同。废弃食用油中含有1980PPm水2.5%的自由脂肪酸和4.6%的乙酸甘油。我们明白大于500PPm 水分将减少甘油三酯的甲基化，但是并不影响反应的平衡。因此，我们首

16、先研究水在废弃油甲 基化中的影响。当植物油在1/3mol甲醇中甲基化时在1小时和7小时中的转化率分别是90%和 33.2%（如图 2）。即使甲醇分解作用被脂肪转移到一个新鲜的基体之内重复时，转化率也不会 发生改变。废弃油的醇解作用同样被重复（如图3），在第一周期中， 1小时后的转化比植物油甲醇分 解作用慢，这种转化重复出现频率增加；在第二、第三、第五周期中转化在一个小时后开始； 转化率分别为 3.0%、8.3%、10.7%。这些结果表明在反应周期中如果有少量水存在的条件下醇 解作用也会被停止，这些水则会被除去。135Cycle number(器)11.9曹矍 lloCJID 2D 304050Resction lime (h)亠2 匸oJJaALIoo图 3 图 4废弃油醇解作