湖塘水体叶绿素a测定

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1、实验2-4湖塘水体叶绿素a测定实验4.1 实验目的及要求（1）初步了解叶绿素 a 测定的原理和方法；（2）通过实验，掌握叶绿素 a 的测定方法及富营养化水样的前处理方法；（3）熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。4.2 实验原理浮游植物的主要光合色素是叶绿色（Chlorophyll）,常见的有叶绿素a、b 和c。叶绿素a （chl-a）存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1-2%, 是估算浮游植物生物量的重要指标，因此浮游植物叶绿素a含量的测定成为浮 游植物生物量的重要指标而被广泛应用。浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效 液相色谱法（HPLC法）、荧光光度计

2、法和分光光度计法等。主要的细胞破碎法有研磨，低温冻融、超声破碎等。尽管丙酮现在仍广泛 用于实际分析中，但由于丙酮的萃取效率比较差，特别是对蓝藻的叶绿素a的 萃取效率比较低，使得甲醇和乙醇成为替代丙酮的色素萃取剂。不过甲醇对人 体毒性大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应用的叶 绿素 a 的萃取剂。超声破碎法因快速、提取效率高等特点也被研究者所青睐。本实验介绍一种以热乙醇为萃取溶剂，结合超生细胞破碎法为基础的叶绿 素 a 含量测定方法。在天然水体中，浮游植物中不仅存在着具有光合活性的叶绿素a。而且存 在着没有光合活性的脱镁叶绿素a，因此应用叶绿素a作为浮游植物生产量的 主要指标

3、时，必须将叶绿素a与脱镁叶绿素a区分开来。叶绿素a经酸化处理 后，镁原子被氧原子取代，叶绿素a降解为脱镁叶绿素a，脱镁叶绿素a与等 量的叶绿素a相比。在665 nm波长下，具有较低的消光系数，故可用酸化的 方法，测定叶绿素前后光密度的变化。如果天然水体中脱镁叶绿素相对含量较 高，酸化处理后光密度的变化就较小；反之脱镁叶绿素的相对含量越低，酸化处理后光密度的变化就越大，根据这个原理，选用合适的计算公式，就可以汁算出叶绿素a与脱镁叶绿素a的含量。4.3 实验条件4.3.1 实验仪器：1）722光栅分光光度计 1 台；2）抽滤装置（砂心过滤器、负压表、真空泵等）1台；3）4000r/min 离心机

4、1 台；4）15mL 带刻度及螺旋盖的离心分离试管 6个；5）恒温水浴锅 1 台；6）直径0.45pm的醋酸纤维滤膜；7）超声细胞破碎仪 1 台；8）1cm玻璃比色皿2个；9）表面皿若干；10） 10mL 比色管7 个4.3.2 实验材料：1）乙醇（含乙醇 90%）；2）盐酸（1mol/L）4.4 实验步骤4.4.1 水样前处理：实验水样为实验室培养的铜绿微囊澡稀释水样以及 11 号湖塘水，分别取两 份铜绿微囊澡稀释水样各25mL及一份湖塘水样300mL。将水样通过醋酸纤 维滤膜抽滤，抽滤时负压不应大于0.5大气压（50KPa）。抽滤完毕后，用镊 子小心的取下滤膜，将其对着（有浮游植物样品的一

5、面向里），再用普通滤 纸吸压，尽量去除滤膜上的水分；滤膜放置表面皿上冷冻12h以上。4.4.2叶绿素a的提取：将滤膜剪碎，放入具塞离心管，加入6mL热乙醇（75C，恒温提取2min后 用细胞破碎仪破碎，超声时间2s,间隔3s,破碎3min后，用少量提取液清 洗细胞破碎仪探头（小于1ml）。将装有提取液的离心管放入离心机，转速4000r/min下离心lOmin,将上清液移入10mL比色管中，再用2ml热乙醇提 取液清洗，离心两次得到上清液。最后将提取液定容到 10mL。4.4.3Chl-a 含量的测定：用含90%的乙醇溶液作为空白对分光光度计调零。分别记录在750nm与 665nm处各自的吸光度

6、（分别记为750a和665b）, 750nm处的测定是用来进 行浊度校正的，吸光度应很低。665nm处的吸光度应在0.1-0.8单位之间。 在比色皿内加入1滴lmol/L盐酸使酸化，混匀1mino再记录750nm和665nm 处的吸光度（记为750b和665b）。4.5 结果讨论分析在第一次实验中，我们去了 300ml湖塘水进行测定，实验结果发现665nm处 的吸光度只有0.045，不在0.1-0. 8单位之间，实验失败。我们总结分析原因： 应该是水样取的太少，所提取的叶绿素a过少。因此，我们准备加大水样体 积，再次实验以期测得合理数据，评价 11 号湖塘富营养化程度。4.5.1 实验公式通过

7、吸光度的差值来计算对浊度的校正：665a750a=校正后得665a的吸光度.（1）665b750b=校正后得665b的吸光度.（2）用校正后的665a与665b的吸光度值来进行如下计算：叶绿素 a（mg/m3）=29.62X（665a-665b）X5 / vi XL（3）式中：5乙醇准确体积ml；水样的体积L；L 比色皿的长度 cm。4.5.2数据记录编号取样量/ml665a665b750a750b学平行11000.0480.3510.0560.058姐样品0.0490.3510.0550.0590.0480.3510.0550.058平行21000.4560.3220.0220.0240.4

8、560.3220.0220.0240.4560.3220.0220.02411号 湖 塘 样 品实验110000.1760.1850.2150.2020.1740.1850.2150.2020.1760.1860.2150.202实验215000.1590.1580.1380.1330.1600.1570.1370.1330.1570.1370.1334.5.3数据记录利用公式（1）、（2）（3）进行数据计算编号A（校正后的665a）A（校正后的665b）叶绿素a的含量学姐平行10.44300.2927445.29样品平行20.43400.2980402.8311号塘实验1-0.0403-0.

9、0167-7.01样品实验20.02220.0243-0.424.5.4数据分析（1）由于本实验是针对11号湖塘进行富营养化的研究，采用11号湖塘的水 进行叶绿素a含量的测定。然而，11号湖塘的水浊度太大了，固体颗粒物太 多了，极容易堵塞滤纸。尽管我们用300目的筛子进行了初步筛离，抽滤速 度还是很慢，1.5L的水样我们用了近9个小时的抽滤，使用0.45Mm滤膜14张。 如此，利用本实验方法已经不可行了。特别是进行提取滤膜中叶绿素a时，由于滤膜的量太大，占离心管体积近，加入6ml热乙醇已经无法完全的提取出14张滤纸中的叶绿素a。(2) 而且在用超声波破碎浮游植物细胞时，超声波只能作用到离心管中

10、部， 底层的滤纸仍然沉降在底部，可见超声波破碎法在本次实验中也已经不可行 了。经过学姐提议，我们采纳浓缩提取法。先加入过量的热乙醇多次进行离 心分离提取叶绿素a,再用氮吹法浓缩乙醇溶液，最后定容到10ml的比色管进 行分光光度测量。(3) 而且在实验过程中，我们提取叶绿素a的时间过长，没有采取避光措施。 温度过高、有光照条件以及加热时间过长，均可能破坏Chl-a的稳定性。(4) 例外我们观察数据，发现750a的值已经大于665a的值了，可见水样浊 度的影响太大了，影响程度已经超过叶绿素a的吸光程度了。综上实验过程分析，由于11号湖塘水的特殊性，我们灵活应对，采用多 种实验方法同时利用。然而，我

11、们也由于没有采用标准方法，引入了一定的 实验误差。实验结果的准确性不能得以保证。4.6 结论：(1) 本实验失败的主要原因是， 11 号湖塘浊度太大，固体颗粒物太大。(2) 由于我们用叶绿素a法，无法准确的评价11号湖塘的富营养化程度，我们结合实验 2-5 湖塘生物多样性调查，用显微镜观察 11 号湖塘浮游植物 的生长情况，发现11号湖塘只有极少浮游植物。因此，我们判定， 11 号实验塘浮游植物数量极少，属于超贫富营养化湖 塘。4.7 实验思考题：4.7.1 查阅资料，根据所得的叶绿素 a 的含量，判断所测水样富营养化程度，并 说明依据。答：但纯以叶绿素 a 为营养化程度的指标：表1叶绿素a与

12、湖泊富营养化关系单位：mg/m营养类型超贫营养贫营养中营养富营养日本吉村(1937)10Seirgensew(1980) 0.010.5 0.33.0 215 10500 然而以叶绿素a为指标来评价水体富营养化程度，属单因子评价，该方法较 简单，但是由于影响水体富营养化的因素除了生物因素外,还有物理的、 化 学的因素等，而且这些都是互相影响的。以某一因子评价有时会与客实际有 出入，甚至各单项评价会有矛盾的的结果，因此应进行综合评价。2 综合营养指数法(TLI)对南湖水体进行富营养化评价。以叶绿素a含量为基 准指标，选用指标包括叶绿素a含量、TP、TN、透明度和高锰酸盐指数。 常温期各区水体评价

13、综合了这5个指标，月份评价则采用了叶绿素a含量、 TP和TN。综合营养状态指数(T,范围0100)、第j种指标营养状态指数(Tj) 计算见式(1)和式(2)，其中第J种指标营养状态指数的计算常数Aj和Bj具 体见表 4。131j=lT=站/希T =式中：w，为以叶绿素a含量为基准，第j种指标的营养状态指数的综合权重; 为指标个数；为第种指标与基准指标叶绿素a含量的相关系数；为第j种 指标的质量浓度数值。根据综合营养状态指数，对湖泊营养状态进行分级：T50为富营养。而富营养状态 又可细分为3个级别：50VTW60为轻度富营养；607 0 为重度富营养。表 2营养状态指数的计算常数Table 2T

14、LI method constants指标透明度C0DMqTPTN叶绿素a含量-19.4026.6116.2416.9451.181.0994.3654.5324.7.2 试对热乙醇超声法的优缺点加以分析。答：实验表明，叶绿素a的提取受到许多冈素的影响。其中乙醇浓度对叶绿 素 a 的提取影响非常显著，在所采取的条件下，乙醇浓度越高，越容易引起 细胞溶胀，使得叶绿素a溶出，因而叶绿素a含量越高。而温度对叶绿素a 的提取影响也很大，本实验表明，随着温度的升高，叶绿索a的含量逐渐增 力口，但是温度过高，很容易破坏叶绿素a,使得溶剂中叶绿素a含量下降。与丙酮提取法相比，超声辅助热乙醇提取法效率高，误差小，而且乙醇对人 体健康的影响远远小于丙酮，所以该法是一种更准确、安全的测定浮游植物 叶绿素a的方法。比较叶绿索a舍量测定的乙醇法和丙酮法操作过程可以看 出，丙酮法的测定过程比较繁杂，其中样品研磨需花费大量时间和精力，且 不容易将浮游植物细胞完全磨碎，影响到叶绿素a的萃取效率.而乙醇法由 下样品经过冷冻和快速热水沿提取，运用冷热差将浮游植物细胞破碎，再力 上超声波的粉碎作用，且热溶液的革取效果高于冷溶液.对叶绿素a的萃取 较完全，且省时省力.不过，过高的温度会破坏叶绿素a,在操作时必须严 格控制水浴温度(80C)和热萃取时间(2min)，防止过高温度破坏