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1、第八章 饲料中其它有毒成分分析本章所介绍的饲料有毒成分包括两个方面的内容：1、饲料调制不当产生的有毒物质。例如：许多青绿饲料加工不得法，可产生大量的亚硝酸盐；蛋白质含量高的饲料如果错误地进行发酵则可产生大量有毒的蛋白质分解产物。这些有毒物质都可引起畜禽中毒。2、饲料本身含有的少量有毒成分。如棉籽饼中的棉酚、高梁苗中的氰甙等，这些饲料如果饲喂前不作去毒处理，长期大量饲喂，可引起中毒。有毒植物本身不作为饲料，故不列为本章的内容，但在兽医临床上，特别在放牧家畜的疾病中，误食有毒植物引起的中毒时有发生，对此有兴趣的同学可参阅家畜中毒学书籍。由于饲料中有毒成分范围广、性质各不相同，故样品处理和分析方法也
2、没有规律性。本章将介绍亚硝酸盐、氰化物、硫甙、棉酚的分析。第一节 亚硝酸盐分析一、概述青绿饲料（包括叶菜类、牧草、野菜等）及树叶类饲料，都不同程度地含有硝酸盐，其中尤以叶菜类饲料，如小白菜、青菜等含量较高，在新鲜的叶菜类饲料中硝酸盐的含量可高达数千ppm，但一般不含亚硝酸盐或含量甚微，通常多低于1ppm。对动物来说，硝酸盐是低毒的，而亚硝酸盐则是高毒的，临床上多见的畜禽中毒都是由硝酸盐转化为亚硝酸盐而引起的。 硝酸盐转化为亚硝酸盐的条件自然界很多细菌和真菌都含有硝酸盐还原酶，能将硝酸盐还原成亚硝酸盐（通常将这些微生物称为硝酸盐还原菌）。硝酸盐还原菌的种类很多，广泛存在于土壤、水等外界环境以及动
3、物的胃肠道和口腔等器官中。体内外的硝酸盐还原菌如遇到适宜的条件，可大量繁殖，将硝酸盐还原为亚硝酸盐。饲料中的硝酸盐转化为亚硝酸盐，可发生于动物摄食硝酸盐以前（体外转化），也可发生在摄入体内之后（即体内转化）。1、体外转化体外转化在生产实践中常见于如下两种场合： 青绿饲料长时间高温堆放青绿饲料，尤其是经虫害、踏过的青绿饲料，堆放于潮湿闷热的环境中，混杂于饲料中的某些硝酸盐还原菌得到适宜的温度、水分，大量繁殖，迅速将硝酸盐还原成亚硝酸盐。 青绿饲料用小火焖煮或煮后久置青绿饲料用小火焖煮时，煮成半生半熟，混杂于饲料中的细菌不但大多未被杀死，反而得到适宜的温度和水分。因此，与潮湿高温堆放一样，极易促使
4、硝酸盐转化为亚硝酸盐。此外，煮熟的青绿饲料放在不清洁的容器中，如果温度较高，存放时间过久，亚硝酸盐的含量也可增加。2、体内转化即饲料中的硝酸盐被家畜采食后，经胃肠道中微生物的作用而转化为亚硝酸盐。反刍动物（有时也见于单胃动物）在采食新鲜的青绿饲料后，有时发生亚硝酸盐中毒，其原因就在于此。反刍动物在日粮搭配正常或富含碳水化合物的情况下，摄入的硝酸盐在瘤胃微生物的作用下还原成亚硝酸盐，并进一步还原成氨而被利用。所以，只要摄入的硝酸盐的量同瘤胃还原能力保持平衡，则不会引起中毒。但是当反刍动物瘤胃的pH值、还原所需的氢供给及微生物群发生变化，亚硝酸盐还原氨的速度受到限制时，摄入过多的硝酸盐，就极易引起
5、亚硝酸盐的积累而导致中毒。 亚硝酸盐中毒机理和临床症状亚硝酸盐毒性程度主要取决于其数量。食欲越好，吃得越多的动物，中毒机会也越多。不同动物对亚硝酸盐的敏感性有很大的差异，其中猪最敏感，牛、羊次之。亚硝酸盐中毒机理： 亚硝酸盐是一种血液毒，其进入血液后，与血红蛋白相互作用，使血红蛋白中的二价铁氧化为三价铁而形成高铁血红蛋白（methemoglobin，简称MHb），又称变性血红蛋白，使血液失去携氧能力，造成组织细胞缺氧。 亚硝酸盐可直接作用于血管平滑肌，松驰血管平滑肌，导致血管扩张，外周循环衰竭。中毒家畜表现为一系列缺氧症状：高度呼吸困难，肌肉震颤，皮肤呈乌青色，粘膜发绀，血液暗红色，凝固不良。
6、 饲料中亚硝酸盐的卫生标准饲料中亚硝酸盐允许含量（以亚硝酸钠计），在我国国家饲料卫生标准中作了规定（表81）饲 料 名 称亚硝酸盐允许量（mg/kg）鱼粉60鸡配合饲料，猪配合、混合饲料15二、样品处理亚硝酸盐是一种水溶性毒物，所以样品处理比较简单。取样品510g，研碎，加水至100ml，振荡数分钟，过滤，取中间滤液10ml作为供试液。如果滤液中色素含量较高，可用活性炭脱色。三、亚硝酸盐定量分析亚硝酸盐的定量分析常采用重氮偶合比色法。依据使用试剂不同分为盐酸萘乙二胺法和萘胺比色法。两种方法均具有较好的准确度和精密度，可随意选择。 萘胺法（格利斯法，Griess法）1、原理：亚硝酸盐在弱酸性条件
7、下与对氨基苯磺酸反应，生成重氮盐后，再与萘胺偶合形成紫红色染料，与标准系列比较定量。2、仪器与器皿分光光度计，比色管。3、试剂 亚硝酸钠标准液：精密称取经115+5干燥至恒重的分析纯亚硝酸钠0.1495g，用水溶解，移入100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，此液每ml相当于1mgNO2-。 亚硝酸钠标准使用液：吸取亚硝酸钠标准贮备液1ml，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，此标准液每ml相当于10ugNO2-。 对氨基苯磺酸溶液：取0.3g对氨基苯磺酸溶于150ml12%醋酸溶液中。贮存于棕色瓶中。如溶液有颜色，临用时加入少许活性炭加热至80并进行过滤，即可脱色。 盐酸萘胺溶液：取0.2g
8、盐酸萘胺溶于20ml水中，加浓盐酸0.5ml，微热溶解，加水稀释至100ml。贮存于棕色瓶中。如有颜色，可用活性炭脱色。 醋酸钠缓冲液：取16.4g无水醋酸钠，溶于100ml水中。4、操作取供试液2ml，标准液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，分别加入50ml大试管中，加水稀释至25ml。于标准管和样品管中分别加入0.5ml醋酸钠缓冲液，1ml对氨基苯磺酸溶液和1ml盐酸萘胺溶液，摇匀放置10min，以零管作参比，1cm比色皿，于波长525nm处测定吸光度。根据标准管各种浓度所测定的吸收度绘出标准曲线。根据检液所测的吸收度从标准曲线上查出检液的含量（A），再算出样品中亚硝酸盐
9、的含量：亚硝酸盐含量=1000（mg/kg）=式中：A样品管测得的含量（mg）；m称取样品质量（g）。 盐酸萘乙二胺法（国家标准法）1、原理 在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应，生成重氮化合物，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准系列比色定量。2、仪器与器皿分光光度计，比色管。3、试剂 0.4%对氨基苯磺酸溶液：取0.4g对氨基苯磺酸溶于100ml20%盐酸中，贮存于棕色瓶中。如溶液有颜色，临用时加入少许活性炭加热至80并进行过滤，备用。一周内使用。 0.2%盐酸萘乙二胺盐溶液：取0.2g盐酸萘乙二胺溶于100ml水中。贮存于棕色瓶中。一日内使用。 亚硝酸钠标准液：精确称取0.1
10、000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解，置于500ml容量瓶中，加水稀释至刻度，此液每ml相当于200mg NO2-。 亚硝酸钠标准使用液：吸取亚硝酸钠标准液5.00ml，置于200ml容量瓶中，加水稀释至刻度。此液每ml相当于5mg NO2-。4、操作取七只50ml容量瓶按下表操作：管 号0123456标准液（ml）0.00.51.01.52.02.5样液(ml)2.00.4%对氨基苯磺酸溶液(ml)2.0混匀，静置35min。0.2%盐酸萘乙二胺盐溶液(ml)1.0蒸馏水至50ml。混匀，静置15min。以零管调零，于波长538nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液中所
11、含NO2-质量为横坐标，绘制标准曲线，或计算回归方程，根据样液的吸光度，求样液中亚硝酸盐的含量。5、结果计算亚硝酸盐含量（mg/kg）=1000（mg/kg）=式中：A样品管测得的含量（mg）；m称取样品质量（g）。四、亚硝酸盐的定性分析亚硝酸盐的定性分析方法，常用格利斯法和联苯胺冰醋酸法，有时也用安替比林法。 对氨基苯磺酸重氮法（格利斯法，Griess法）1、原理 亚硝酸盐在弱酸性条件下与对氨基苯磺酸反应，生成重氮化盐后，再与a萘胺偶合形成紫红色染料。2、试剂 对氨基苯磺酸溶液：取0。5g对氨基苯磺酸溶于150ml30%醋酸中。 a萘胺溶液：取0.1g萘胺溶于20ml水中，过滤，滤液加入15
12、0ml30%醋酸，混匀。 格利斯试液：将和等量混合。3、操作：取供试液1滴于白磁板上，加入12滴格利斯试液，如含亚硝酸盐，则出现紫红色。 联苯胺冰醋酸法1、原理 在酸性溶液中，亚硝酸盐能将联苯胺重氮化，然后水解并氧化成棕色的联苯醌。用以鉴定有无亚硝酸盐存在。2、试剂0.1%联苯胺冰醋酸溶液：取0.1g联苯胺溶于10ml冰醋酸中，加水稀释至100ml。3、操作 取供试液1滴于白磁板上加联苯胺冰醋酸溶液1滴，如含亚硝酸盐，则出现棕红色。 安替比林法1、原理 在酸性条件下，亚硝酸盐使安替比林亚硝酸基化，溶液呈绿色。2、试剂安替比林溶液：取5g安替比林，溶于100ml2N硫酸中。3、操作 取供试液2滴
13、于滴板上，加安替比林液2滴。如出现绿色，示有亚硝酸盐存在。第二节 氰化物的分析一、概述氰化物系指含氰基（CN）的化合物。植物中的氰化物是以甙（配糖体）形式存在的氢氰酸有机衍生物（即氰甙）。如苦杏仁中的苦杏仁甙；高梁和玉米新鲜幼苗中的蜀黍甙。氰甙本身无毒性，但当其水解释放出游离的HCN后，就会引起动物中毒。 氰甙水解产生氢氰酸的途径氰甙水解产生氢氰酸的途径有两条：1、酶解 含氰甙的植物中都存在水解酶。在完整的植物体内，由于氰甙与其水解酶存在于同一器官的不同细胞中，氰甙不会受到水解酶的作用，故植物中不存在游离的氢氰酸。只有当植物完整的细胞受到破坏，氰甙与其水解酶接触，水解反应才回迅速进行。氰甙首先
14、在b-葡萄糖甙酶的作用下，其糖甙键水解产生a-羟腈和葡萄糖。a-羟腈在羟腈裂解酶作用下裂解，释放出氢氰酸和相应的羰基化合物。2、稀酸水解 氰甙的b-糖甙键对酸不稳定，可被稀酸破坏，产生糖和a-羟腈，后者由于性质不稳定，可进一步分解产生氢氰酸和相应的羰基化合物。酶解与稀酸水解两者产物相同。 富含氰甙的植物和青饲料木薯、高粱和玉米的幼苗、亚麻、络麻、海南刀豆、狗爪豆以及蔷薇科植物（如桃、梨、梅、杏、枇杷、樱桃等）的叶子和种子。 氰甙中毒机理氰基是一种非特异性的酶抑制剂，能抑制细胞内多种含金属离子的酶系统，如细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、接触酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶等共40多种酶，其中最显著的是细
15、胞色素氧化酶。氰基抑制细胞色素氧化酶的机制是氰基能迅速地同氧化型细胞色素氧化酶的辅基三价铁离子结合，使其不能转变为具有二价铁离子辅基的还原型细胞色素氧化酶，从而丧失传递电子、激活分子氧的作用，阻止组织对氧的吸收，破坏组织内的氧化过程，导致机体内缺氧症。口服氢氰酸2.3mg/Kg体重即可致死。对牛、马来说，采食含氰甙59.4%的木薯块根皮11.5Kg即可引起死亡。空气中氢氰酸浓度超过0.2mg/L也可致死，所以，在做氰化物分析时应予以注意。氢氰酸中毒发病迅速，当动物过食含氰甙的饲料1520min，即可发生中毒现象。中毒家畜表现为呼吸困难、呕吐、流涎、肌肉痉挛，可视粘膜鲜红色。剖检血液鲜红色，胃肠有出血性炎症。（亚硝酸盐：高度呼吸困难，肌肉震颤，皮肤呈乌青色，粘膜发绀，血液暗红色，凝固不良。） 饲料中氰化物的卫生标准
