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1、深度解读Nature丨简单抑制自噬治疗肿瘤或不可取一一重新审视自噬在肿瘤发生发展中的重要作用撰文丨QY责编丨迦溆图片引自：/articles/318927.php上世纪60年代初, Leonard Hayflick 发现在体外培养的正常细胞 并不能无限增殖下去，在一定的代数后便会走向衰老和死亡，这一现 象称为细胞的 Hayflick 极限【1】。这种现象可由多种因素触发, 如染 色质端粒（Telomere）长度变短、夕卜界环境刺激、DNA损伤和癌基因、 抑癌基因的失调等【2】。p53/p21CIP1通路和p16INK4A/pRb通路 介导了绝大多数细胞老化，在体夕培养的细胞中，有一些细胞这些通
2、 路会被失活，从而越过这个界限（下图中的Senescenee ）。越过这个 界限的细胞会继续增殖，进入下一阶段（下图中的Crisis ），但是这会 带来另夕的一些问题，比如：端粒会进一步变短。此时细胞内会发生 一系列的事件，比如：染色体末端的融合，基因组的不稳定等，大量的越过上一个界限的细胞将会在此阶段走向死亡，这一阶段称为Replicative Crisis【3】。然而，一些细胞也会越过这个极限，越过这 个极限的细胞通常会恶性增殖，基因组极不稳定【4】。无限增殖的肿 瘤细胞也必须要越过这两个界限，从而获得无限增值的能力。Replicative Crisis 阶段也被认为是细胞发生恶性转换的最
3、后一道防线 因此，研究此阶段细胞的生物学特征、分子机制以及其干预机制，无 论是对于理解细胞增殖的基础生物学问题，还是肿瘤的发生发展，以 及衰老的生物学基础，以及发展其干预措施都具有重要的意义。H1ON 山I山 H山 IAI01LU1来自美国Salk Institute的Jan Karlseder教授长期致力于端粒以 及DNA损伤修复领域的基础研究，并在相关领域取得了一系列研究进 展。2015 年在 Nature杂志发表了题为：Cell death during crisis is mediated by mitotic telomere deprotection文章，扌报道了细胞在 Repli
4、cative Crisis 时期，染色体端粒的损伤会直接导致细胞周期的阻 滞，以及细胞在有丝分裂中或者下一个细胞周期中死亡【5】 ，揭示了 细胞在 Crisis 期死亡的相关机制。然而这一领域中，长期以来都认为 在这一阶段细胞将走向传统的细胞凋亡方式死亡，但是缺乏相应的证 据，这一特殊细胞时期其细胞死亡的方式及其具体的分子机制仍不明 确。近日， Jan Karlseder 教授再次在 Nature 杂志发表了题为： Autophagic cell death restricts chromosomalinstability during replicative crisis的文章，阐明了 Au
5、tophagy在这一时期中细胞死亡 过程中的重要作用，作者证明了在这一时期的细胞，端粒DNA的损伤 会导致DNA释放到细胞质中，这种释放到细胞质中的DNA能够被细 胞内的DNA sensor: cGAS-STING所感知，从而激活autophagy的 发生，autophagy降解了细胞内的重要组分，从而导致这一时期细胞 的死亡。值得一提的，在2018年 10 月份的苏州冷泉港亚洲会议上， Jan Karlseder教授作为Key note speaker已经展示过这篇文章的相关 data。LETTERAutophagic cell death restricts chromosomal ins
6、tability during replicative crisisJoe Nassonrk Robert Rardford1, Adriana Correia1,. Javiei Miralles Fust Brigitte Schoell2. Anna Jauch. Reuben J. Shaw* & Jjn Karbieder1*Jan Karlseder教授在研究Replicative Crisis时期的细胞中发现， 进入 Crisis 时期的细胞中有大量的空泡状结构存在，这种空泡状结构 非常像 autophagy 过程中的 autophagsome 以及 autolysosome 结
7、 构，这种结构的存在提示了 autophagy在Replicative Crisis这一时 期细胞死亡中可能起着重要的作用。因此，作者对这一现象进行了深 入研究。作者发现，当细胞进入Crisis时期后，autophagy相关的蛋 白：LAMP1, ATG5-ATG12以及检测autophagy的金标准LC引-II的 转化都显著升高，同时 P62 蛋白水平下降，这一时期细胞凋亡的marker 并未有显著提高，这些结果都提示了 autophagy 过程在这一 时期却是显著上调。为了进一步证实autophagy却是在该时期的细胞中大量发生，作 者使用 mCherry-EGFP-LC3 （检测 aut
8、ophagy 常用的工具 ，当 mCherry-EGFP-LC3未与溶酶体融合时候，呈现黄色荧光，当LC3与 溶酶体融合后，由于溶酶体内的酸性环境，EGFP被失活，不再发生绿 色荧光，而mCherry可以继续发出红色荧光【6,7】）检测细胞内的 autophagy flux水平，同样发现在细胞进入Crisis时期后，细胞内的 autophagy flux会显著升高（下图）。这些结果表明，autophagy会 在细胞进入Crisis时期后显著升高，提示了 autophagy在这一时期起 着重要的作用。aPDasHMECiQfiSiSi0 0 0 0 0 0 0 LE n 右Full-felh P
9、.ARF1 PAHP1 CASP3LAMP1ATG-ATG12 0 P62GAPDH嚅曲Crhi-iSCrisiECrsiiCrisis时期细胞中Autophagy水平明显升高PDKJ0EoLJliMHQsd4窑!rt - i 當AC孟 日 -i 一B4由于autophagy对于细胞的作用是一把双刃剑，既可以促进细胞 的死亡，在另外一些条件下（比如：营养缺乏等）会促进细胞的存活 【8】。为了进一步探寻 autophagy 在这一时期细胞中的具体作用， 即到底是促进了细胞在这一时期的死亡，还是帮助细胞“逃离”这一 时期，从而发生恶性转变，获得无限增殖的能力。作者在多种细胞中 分别敲低了多种 au
10、tophagy 相关的基因，抑制 autophagy 后观察细 胞在这一时期的变化。作者发现，敲除autophag y相关基因，对于到 达Crisis之前的细胞的分裂、增殖以及基因组的稳定性并无显著影响， 但是，当细胞进入Crisis时期后，抑制autophagy会抑制细胞的死亡， 促进这一时期细胞的生长，导致细胞大量的增殖。以上的实验数据表明，抑制 autophagy 可以帮助细胞度过 replicative crisis, 也就是说，在 crisis 期，细胞的死亡是依赖于 autophagy 的。因此作者提出了一个问题，这个过程中较高水平的 autophagy 是如何被触发的？细胞是通过
11、一种怎样的机制感知到了细 胞已经进入Crisis时期，并激活autophagy，从而导致细胞死亡，不 再进行恶性增长。作者接下来对这一问题进行了详细的探索，细胞进入 Crisis 时期 的典型特征就是端粒的损伤，那么是否端粒的损伤就能诱导 autophagy 的发生，而不需要细胞进入 Crisis 时期？作者 2015 年 Nature 文章的发现， TRF2 敲低会导致端粒的损伤形成 telomere dysfunction-induced damage foci 以及造成染色体的 end-to-end 融合。作者发现，在未进入Crisis时期的细胞中，敲低TRF2就会导致 autophag
12、y相关蛋白水平的升高，P62的降低，以及autophagy flux 的显著增强。作者通过这些实验证实了端粒的损伤确实会诱导 autophagy 的发生，这一过程并不需要细胞进入 Crisis 时期。另外， 作者还在正常细胞染色体的不同位置引入DNA损伤，研究结果表明， 在端粒位置的损伤会触发自噬反应，而在其他染色体区域的损伤则会 引起细胞凋亡。这个结果进一步解释了所观察到的结果，还证实细胞 凋亡并不是唯一能够因为DNA损伤而杀死致癌细胞的途径，也就是说， 这种端粒的损伤诱导autophagy的产生也能促进细胞的死亡。那么端粒的损伤如何被细胞所感知，又如何诱导autophagy的发 生？端粒的
13、损伤会导致细胞内的相邻染色体的融合形成融合染色体， 这种染色体在细胞分离时候会具有两个着丝粒，在细胞分离时候不能 正确的分离，导致DNA的断裂，将细胞核中的DNA释放到细胞质中， 形成微核(micro nuclei)结构。细胞质中的DNA以及微核的结构能够被 细胞内的 cGAS-STING pathway 所感知，从而介导细胞天然免疫下 游信号通路的激活，另外，cGAS-STING通路的激活也能诱导 autophagy 的发生。作者发现，细胞质中的染色体片段，微核结构在 进入 Crisis 期的细胞中逐渐积累，同时，细胞质中的 DNA 片段与 cGAS以及mCherry-LC3以及P62都有非
14、常好的共定位现象。提示了 cGAS-STING pathway对于Crisis诱导的autophagy起着至关重要 的作用。作者在细胞中敲低cGAS或者STING后发现，端粒损伤诱导 的 autophagy 显著降低，同时，与敲低 autophagy 相关基因的表型 一致，敲低的细胞能够更好地度过 replicative crisis 时期，进而获得 无限增殖的能力。作者通过以上的一系列实验数据，提出了在细胞面临 telomere crisis 的时通过 autophagy 通过降解一些细胞内关键的组分，从而诱 导细胞走向死亡的全新的理论。为autophagy维护基因组稳定性提供 了全新的证据
15、支撑。另外，这也为一些以抑制autophagy过程为主的 癌症治疗方法提出了新的挑战。当抑制autophagy后可能会帮助一些 细胞度过 replicative crisis 时期，获得无限增殖的能力，因此需要重 新审视autophagy在肿瘤的发生发展过程中的重要作用，简单的抑制 autophag y作为抗肿瘤治疗手段是不完善的。另外，为什么在染色体末端的DNA损伤会诱导autophagy而位 于染色体其他地方的DNA损伤不会诱导autophagy也是尚未解决的 问题，cGAS-STING与autophagy之间的Crosstalk等问题还需要更 加深入以及细致的研究，从而为肿瘤等疾病的发生
16、发展以及衰老等生 物学过程提供新的理解，从而开发相应的干预措施。原文链接：/articles/s41586-019-0885-0参考文献1. L. Hayflick, THE LIMITED IN VITRO LIFETIME OF HUMAN DIPLOID CELL STRAINS. Experimental cell research37, 614-636 (1965).2. A. Prieur, D. S. Peeper, Cellular senescence in vivo: a barrier to tumorigenesis.Curr Opin Cell Biol20, 150-155 (2008).3. W. E. Wright, O. M. Pereira-Smith, J. W. Shay, Reversible cellular sene
