质粒DNA的分离、纯化和鉴定

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1、第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定第一节 概 述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 （Vector）。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从l-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋 状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子 代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶 和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些

2、额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒（又称F因子或性质粒）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（产大肠 杆菌素因子）等都是常见的天然质粒。质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型（Stringent control）和松驰控制型（Relaxed control）。前者只 在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有1个或几个质粒 分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上， 如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均 受到抑制，紧密型质粒复制

3、停止，而捾驰压褨碒竧竭复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个， 此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复 制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却 占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称 质粒的不相容性（Incompatibility）。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性

4、，产生某些抗生素，降解复杂有机物，产生 大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有 一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点 的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体 带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链 DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大 致应有下列一些特性：（1）分子

5、量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切 点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb 至 10kb 之间，如 PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和 pBluescript （简称 pBS）等。从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质 粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌 酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA

6、比 质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细 菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链 不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片 缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它 形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋

7、转而消除链的张力， 形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA,简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处 断裂，则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度 要比开环和线状分子的泳动速度快。第二节 材料、设备及试剂一、材料含pBS的E. coli DH5a或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管)，离心管架。二、设备微量取液器(20p l,200p l,1000p l)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋 振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴

8、锅等。三、试剂1、LB 液体培养基(Luria-Bertani):称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g， 溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。3、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20C保存备用。4、溶菌酶溶液：用10mmol/L TrisCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20C, 每一小份一经使用后便予丢弃。

9、5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml 水中溶解 40.81g NaAc 3H2 O,用冰醋酸调 pH 至 5.2,加水定容至 100ml, 分装后高压灭菌,储存于4C冰箱。6、 溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.O), 10mmol/L EDTA (pH8.O)。溶液I可成批 配制，每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4C冰箱。7、溶液 II： 0.2 mol/L NaOH (临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释)，1% SDS。8、 溶液III： 5 mol/L KAc 60ml,冰醋酸11.5ml, H2O

10、28.5ml,定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac _ 5mol/L。9、RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液, 于100C加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20C。10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应 在160C用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/LTrisC

11、l (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性 条件下DNA会分配于有机相。11、氯仿:按氯仿:异戊醇二24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊 醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积二1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯 仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。12、TE 缓冲液：10 mmo/L Tris Cl (pH8.0), 1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于 4C冰箱中。13、STET： 0.1 mol/L NaCl, 10m

12、mol/L Tris Cl(pH8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0),5% Triton X-100。14、STE： 0.1mol/L NaCl, 10mmol/L Tris Cl(pH8.0), 1mmol/L EDTA (pH8.0)。15、 电泳所用试剂：(1) TBE缓冲液(5X)：称取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA (pH8.0) 20ml,定溶至1000ml。(2)上样缓冲液(6X)： 0.25%溴酚蓝，40% (w/v)蔗糖水溶液。第三节 操作步骤一、细菌的培养和收集将含有质粒pBS的DH5a菌种接种在LB固体培养基(含50p g/

13、ml Amp)中,37C培养12-24小时。用无菌 牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50p g/ml Amp)中,37C振荡培养约12小时至对数生长后期。二、质粒DNA少量快速提取质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是 简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。一）、煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4C下12000 g离心30秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中，涡旋混匀。4、加入10ml新配

14、制的溶菌酶溶液（10mg/ml）,涡旋振荡3秒钟。5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。6、用微量离心机4C下12000g离心10分钟。7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。8、取 20ml 进行电泳检查。注意1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但 RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应 等。（二）、 碱法1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4C

15、下12000g离心30秒。2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100p l溶液I中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。4、加入新配制的溶液II200p l,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡）, 冰浴 5 分钟。5、加入150p l预冷的溶液III,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟,4C 下12000g离心5-10分钟。6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1）,振荡混匀,4C下12000g离心5分钟。7、将水相移入干净eppendorf管中，加入2

16、倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20C冰箱中20分钟，然后4C 下12000g离心10分钟。8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次,4C下12000g离心 5-10分钟。9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20p l TE缓冲液（pH8.0,含20p g /ml RNaseA）中，储于-20C冰箱中。注意1. 提取过程应尽量保持低温。2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除 干净需多次抽提。3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀D