《Trizol法提取RNA实验步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Trizol法提取RNA实验步骤（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Trizol 法使用步骤一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RN质量的高低常常影响cDNA库，RT-PC和Northern Blot等分子生物学 实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物 质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。1.5ml Eppendorf 管二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、 Glycogen （可能需要）、（RNase-free ）、 Tips （RNase-free ） 三、准备工作RNase非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的 条件可以暂时失活，但限制因素去除后
2、有迅速复性。用常规的高温高压 蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是 RNase全失活。它广泛存在于人 的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 RNas的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行 处理。一般情况下采用用DEP配制的70临醇擦洗取液器的内部和外部， 基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。1、料制品的处理尽可能使用无菌， 一次性塑料制品， 已标明 RNase-Free 的塑料制品， 如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上 都必须处理方可使用。处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入 DEP使 DE
3、P的终浓度为0.1%。注 意：DEP为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入 DEP水溶液, 使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。3）在通风柜中室温处理过夜。4）将DEP水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已 DEP水处理过的 塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少 30分钟。5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。2、璃玻和金属物品250 C烘烤3小时以上四、从组织中提取总 RNA1) 液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol 加入
4、Trizol ，转入离心管进行第 2步操作。2)匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，组织体积不能超过 Trizol 体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充 分匀浆约需 1-2分钟。五、从细胞中提取总 RNA1) 培养贴壁细胞： 不须消化， 可直接用 Trizol 进行消化、 裂解， Trizol 体积按 10cm/ml 比例加入。62) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5X 10动物、植物 或酵母细胞，或107细菌细胞。六、操作步骤1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min,使其充分裂解。注：此时 可放入-70 C长
5、期保持。2、12,000rpm 离心 5mi n,弃沉淀。3、 按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注: 禁用漩涡振荡器，以免基因组DN断裂。4、4C 12,000g 离心 15min。5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DN彌蛋白质，则保留下层酚相存于4C冰箱，若只提RNA则弃 下层酚相。6、 按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。7、4C 12,000g离心10min，弃上清，RN航于管底。8按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉 淀。9
6、、 4 C 8,000g离心5min，尽量弃上清。10、室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则 很难溶解。11、可用 50ul H2Q TEbuffer 或0.5%SD溶解 RN样品，55-60 C ,5-10min。 注：H2O TE或0.5%SD均须用DEP处理并高压。12、测0.D值定量RNA农度。注：此方法提取 RNAA6c/A280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug 6RNA/106 Cell ）： 5-15ug。注：组织或细胞量过少，可酌情减少 Trizol 用量；组织或细胞用量过 多，会引
7、起DNA寸RNA的污染； 高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或 液氮研磨后须4C 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作， 若顶层有脂肪物，则也须去掉；热天提RNA带手套是必须的，手是 RNase的主要来源；组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀 浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎， 然后再充分研磨。6.1.2.1 肝脏、肠道、肌肉总 RNA 提取方法 使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开，从中取出完整的肝脏、 肠、肌肉等组织，置于离心管后立即放入液氮中； 组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有
8、 ImLTrizol的1.5ml离心管中，充分混合 后于 4C, 12,000rpm离心 15min； 取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4C,12,000rpm 离心 15min； 取上清移至新1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置 20mins，于 4C，12,000rpm离心 15min； 弃上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水现配现用），于4C，12000rpm离心5min， 重复此步骤一次； 弃上清后，室温干燥5-7mi ns； 加入适量（20-30UI）的DEPC水溶解沉淀65C溶解，-20C（最好-80C）
9、保存，检测 RNA 农度，并电泳检测。6.1.2.2 RNA 农度测定和电泳检测取 2ul 提取好的 RNA 溶液，于 Na nodrop 2000 Spectrophptpmeter测定 RNA 浓度及 A260/A280 的相寸吸光度，纯净 RNA 的 A260/A280 应在 1.8-2.2之间。电泳检测：1%琼脂糖，1X ATE缓冲液，90V电泳30min,凝胶成像系统观察，分析结果。6.1.2.3肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成反应按照 TaKaRa 公司的 PrimeScript? RT reage nt Kit With gDNA Eraser ( PerfectReal Ti
10、me)反转录试剂盒说明书进行，合成 cDNA模板。基因组DNA的除去反应，在PCR管中配置如下缓冲液。试剂用量5gDNA Eraser Buffer2.0 卩1gDNA Eraser1.0 卩1Total RNAX* ulRNase Free dHOup to 10 卩1X* :根据检测到的RNA浓度来配置；混合均匀后，室温放置20-30mi n反转录反应，在PCR管中配置如下缓冲液(20ul system)，反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中。试剂使用量5 PrimeScript? Buffer 2 (for Real4.0 ulTime)PrimeScript? RT En zyme Mix I1.0 卩1RT Primer Mix1.0 卩1的反应液10.0 ulRNase Free dHOup to 20 卩1混合均匀后，在PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为:37 C15 min85 C 5 sec然后将得到的cDNA存放于-20C冰箱保存待用
