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1、基因克隆的几种常用方法基因(gene)是遗传物质的最基本单位，也是所有生命活动的基础。不 论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先 将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子 生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。1 根据已知序列克隆基因对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取 基因序列多从文献中查取，即将别人报道的基因序列直接作为自己克 隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列， 而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册， 拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession
2、number),以便别人参考和查询。目前，世界上主要的基因库 有：(1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 http:/www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国 家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html;(3)Swissp ort和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库，其所含序列的准确度比 较高，而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前，以Genbank 的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在
3、 Genbank 注册的基因序 列，也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过In ternet 查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因 文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整 个基因序列设计特异的引物，通过PCR从基因组中克隆该基因，也可 以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是，由于物种和分离株之间的 差异，为了保证PCR扩增的准确性，有必要采用两步扩增法，即nested PCR。根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因 文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的 DNA 或 cDNA 序列。如蛋 白质序列是自己测定
4、的，那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆 的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。另外，在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用的 PCR 酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof) 功能的酶，如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终 止密码子而导致整个研究结论的错误。2 根据已知探针克隆基因这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非 放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将 所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体
5、(质粒、噬菌体或病 毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来, 还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意 高强度(high stringent)漂洗，以避免干扰信号，即保证克隆的特异 性,同时节省时间。3 未知序列的基因打靶根据已知序列进行基因克隆，多数是重复别人的工作，或者是在 别人工作的基础上继续自己的工作，因而不存在新基因的克隆过程。 对未知序列的基因克隆才是真正的创造性研究。31 随机引物法克隆未知序列基因随机引物 PCR(arbitrarily primed PCR, AP-PCR)首先被用于 基因组DNA或RNA的指纹图谱(finger pri
6、nt)分析，后来也有人将这 种方法用于克隆与表型相关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表 型受基因支配，在一个生物体发生了表型变化后，其基因组DNA很可 能发生变化或出现不同基因的激活或关闭等;另一方面，如在寄生虫 的发育过程中，不同发育阶段的虫体所表达的基因很可能不同，如将 不同发育阶段的虫体mRNA提取出来，用单一引物(随机引物,其长度 不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较，即可找出导致 表型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2 种来自不同表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的 产物必须99%是一致的，只有个别特异的产物出现
7、在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关系相差甚远的生物个体之间没有比较意义（见图1）。n图1应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图 谱分析或表型相关基因克隆 箭头所指扩增带为特异于个体（II）的 扩增产物AP-PCR的操作一般采用两步法，即前10个循环多以较低的退火 温度（annealing temperature）进行扩增，后20个循环则采用较高 的退火温度扩增。AP-PCR产物多较短，一般需高浓度的琼脂糖凝胶检 测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。如扩增的模板为mRNA,通过比较扩 增产物的强度，可以得知该基因在2种生物或同一生物不同发育阶段 的表达强度。另外，在AP-PC
8、R检测到与某一表型相关的基因或基因产 物（mRNA）以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主要操作程 序为：（1）AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测 到的特定片段从凝胶中切下，提取DNA克隆到适宜的载体内（如 TA载体)，再测定其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引 物(P-l,P-2，见图2)。引物长度多在20 nt以上；退火温度在60C以 上；(2)将基因组DNA做适当酶切，然后在其两端连接上相同的接头 (见图2,这种接头可从生物制品公司购买)。根据接头的序列扩增。冉.ms产暂 r52 AP-PCR产物的特宦基因的扩增与亘窿3.2 Diffe
9、rential display PCR(DD-PCR)DD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RT-PCR方法，主要用于2 种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。其基本原理是:所 有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列，根据 poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所有的mRNA分子分为 12类(见图3)。 1G IT去 T G /WtAAAaA 一3 C 店 AAATUWU - 沖= ，一 AA- - - -5贮$C T /VtAJWWi 7G 03C C91 T.i3AAflAAAA皆 二 T AAAAAAA11A C1 ?离 G 小“图3真核
10、生物12种mRNA的序列特点MHTrrnrm M r i r 111 mSS机引站PVRLEMAAUJUiJU.一一图4 DD-PCR示意图 箭头所示为特异扩增产物根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即MNTTTTTTTT，用其分别进行反转录，即可将所有mRNA分类合 成12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物，以这12种cDNA 分别做模板进行PCR扩增(见图1和图4),那么与表型相关的mRNA 就很容易被发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2 种种源近似生物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而，其PCR 的模板必须是来自2个生物或同一
11、生物的不同发育阶段的mRNA。 DD-PCR的优点是快速、方便，可以检测表达量极低的mRNA，但其技术 条件要求较高，所扩增的mRNA的质量不能有差异，即mRNA不应降解。 目前这一方法已广泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。3.3 Representative difference analysis PCR (RDA-PCR) 这是一种差减杂交(subtractive hybridizatio-n)与 PCR 相 结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP-PCR和DD-PCR。前2种方法是将两模板DNA或cDNA分别进行PCR扩增,最后通过扩增产物的 差异，分离和克隆特异扩增带，其缺点
12、是需要将特异扩增产物从胶中 切下来，提取DNA,再扩增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表 型的特异基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析（见图5）。图弓RDA-PCR示資图其基本原理是：用一个在种源上相近的基因组将靶基因组中所有 共同的基因掩盖起来，而只暴露出特异的基因,在整个反应中只有特 异基因能被扩增。其操作程序为：（1）用同一限制性内切酶（一般用Bam HI,Bgl II或Hind III）同时处理靶基因组和掩盖基因组DNA，其中 掩盖基因组DNA的量至少要2倍于靶基因组DNA的量；（2）在经酶切 的靶基因组片段的两端加上连接头，其序列与酶切产生的粘性末端的 序列相对应；（3）将
13、2个基因组的DNA混合后，高温变性，低温退火。 由于掩盖基因组DNA的量远大于靶基因组DNA量那么与掩盖基因组 DNA相同的靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异的靶基因 才能重新组合，不会受掩盖基因的影响；（4）用Taq DNA聚合酶将粘性 末端补齐后,加入与连接子相对应的引物，经过30个左右的PCR扩增， 就可以将靶基因组中与掩盖基因不同的特异基因扩增出来。这种方法 的起始操作程序较复杂，各反应步骤要求准确无误，但其检测的准确 度较高。对于基因组内的点突变、重排、插入序列等变化均可检测出 来。4 用特异抗体克隆基因用抗体克隆基因的关键是抗体的特异性。一般以单克隆抗体最为 理想。获取特异
14、抗体的方法主要有:（1）制备识别功能抗原的单克隆抗 体；（2）将SDS-PAGE分离的蛋白质特异带切下免疫动物，其抗体只识 别该特异蛋白质;（3）用 Western-blot 法将识别某一蛋白质带的抗体 从膜上洗脱下来。在获取理想的抗体后，便可以用这些抗体筛选表达 型基因组文库或cDNA文库，从文库中将编码某一特异蛋白质的基因 克隆出来。5 特异基因的功能克隆 它是借助于基因产物即基因所编码的蛋白质的功能将该基因克隆出来的一种方法。基因的功能克隆主要有2种:一是phagedisplay,另一是pep tide display。后者的原理与前者基本相同。 目前以 phage display 的应
15、用最为广泛,本文只对这一方法加以介 绍。任何一种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫,在其对宿主侵入或 致病过程中，病原体本身的蛋白质成分(ligand)需要首先与宿主细胞 上的受体(recep tor)相互识别连接。如口蹄疫病毒需要借助于受体细 胞上的 Heparan sulfate 受体，并与其相互作用后才能侵入细胞内； 巴贝斯虫裂殖子需借助于宿主的补体作为桥梁，才能与红细胞结合并 最后侵入红细胞内。对病原体与宿主受体相互作用成分的特性与功能 分析，是制订免疫预防措施及制备阻断药物的前提。phage display 法是克隆病原体ligand的一种最为理想的手段。fl产谅逾衬与盍停跖言图6 phage display克隆基因示意图Phage display的基本操作过程为：(1)提取某一病原体基因组DNA,用超声波将DNA切割成5001 500的片段；(2)将片段末端用T4DNA聚合酶处理后，与载体DNA(phagemid)连接形成噬菌体质粒。用 这些质粒与辅助噬菌体(helper phage)同时转染大肠杆菌。 phagemid在大肠杆菌内包装成噬菌体，大量繁殖，同时将插入的外源 基因片段表达，表达产物主要集中在噬菌体颗粒的表面；(3)将特定的 受体固定于载体上(多为ELISA板)，方
