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1、10%水合氯醛溶液，中南大学湘雅三医院；XTL-400连续变倍体视显微镜，重庆澳浦东光电 技术有限公司；单极微手术电凝器，武汉春光医疗美容仪器有限公司；眼科器械(眼科弯镊、 眼科直镊、眼科剪、眼科钳等)，视卓医疗器械有限公司；医用缝合针，巢湖市宾雄医疗器械 有限公司；医用真丝编织线(5M灭菌线团)，规格2-0、4-0、5-0,上海浦东金环医疗用品股 份有限公司；碘伏；浓度75%医用酒精；医用棉签；手术刀片；剃须刀片；小鼠解剖台；组 织剪；组织镊；止血钳；持针钳；微型动脉夹；1mL 次性注射器；特制的栓线；电子秤； 红外灯等。实验方法:采用改良的Zea Longa法，本法改良之处在于不暴露翼腭动
2、脉(PPA pterygopalatine artery)，而颈内动脉(ICA internal carotid artery )通过悬挂编织线以及夹动脉夹的方式阻碍 其血流，最后从颈外动脉(ECA external carotid artery)插入栓线。实验步骤:1、对禁食一晚的C57BL/6小鼠称重，以10%水合氯醛溶液按照0.004 mL/g小鼠体重的量对 小鼠进行腹腔注射麻醉。提前准备好用于结扎或阻断动脉的编织线，于生理盐水中浸润。2、数分钟后，若小鼠不能自由翻身则认为已达到麻醉深度要求，将小鼠绑缚于解剖台上， 在小鼠颈下塞以棉签垫高，碘伏消毒小鼠颈部并备皮。3、沿小鼠颈部正中剪开皮
3、肤，用眼科弯镊和眼科直镊在体视显微镜放大视野下钝性分离皮 下组织和脂肪，划开浅肌膜和颈阔肌，暴露出颈深肌膜和气管前肌。4、分离到气管前肌后，在右侧胸锁乳突肌前缘撕开颈深肌膜，显露胸锁乳突肌并将其拉向 后侧，沿胸锁乳突肌向下继续分离，直到暴露较深位置的颈动脉鞘。5、在避免压迫小鼠气管的同时，划开颈动脉鞘，分离出颈总动脉( CCA common carotid artery )并穿线以活结阻断血流，注意不要伤害到鞘内伴行的颈内静脉与迷走神经，对神 经的刺激或损伤可能引起小鼠呼吸骤停。6、沿颈总动脉向上分离，于甲状软骨上缘处分出颈外动脉，颈外动脉位于颈内动脉的上方 内侧，靠近气管。在颈总动脉分为颈内
4、动脉和颈外动脉处有颈动脉窦和颈动脉小球。颈 动脉窦为颈总动脉末端和颈内动脉起始处的膨大部分。7、从颈外动脉起始处前内侧壁发出的小分支为甲状腺上动脉，分离后电凝烧断。继续沿颈 外动脉向上分离可发现第二分支舌动脉，以及枕动脉和颌外动脉。在靠近枕动脉与颌外 动脉分支处以编织线进行双重结扎，在两结扎处中间剪断颈外动脉，近心端结扎线稍微 留长以方便之后插栓。8、稍提起颈外动脉的近心端结扎线，暴露下方外侧的颈内动脉。颈内动脉入颅前分为两支， 位于外侧的翼腭动脉和位于内侧的颈内动脉入颅支。为减少建模手术时间和对小鼠的损 伤，可以不分离翼腭动脉，只需在颈内动脉下穿线以便在插入栓线时悬线阻碍自颈内动 脉的血流。
5、9、在颈外动脉的近心端另外备一活结，暂不系紧，待栓线插入至指定位置之后系紧以固定 栓线。轻轻提起颈外动脉的近心端结扎线，使颈外动脉与颈内动脉方向一致。悬提颈内 动脉下的编织线并以微型动脉夹暂时夹住以控制血流。用眼科剪在颈外动脉的近心端剪 一小口，挑选线头圆润、线身光滑、粗细均匀适宜的栓线从小口处轻轻插入，栓线会从 颈外动脉穿过分叉处进入颈内动脉。注意当栓线进入颈内动脉时应稍稍下压使栓线头端 翘起，这样可避免将栓线插入翼腭动脉。不建议分离或结扎翼腭动脉是因为阻断翼腭动 脉后易形成颈内动脉内血栓，血栓包裹在栓线周围会对拔栓造成困难，不易于模型的再 灌流。10、当栓线插入到 9-10mm 左右时会遇
6、到轻微阻力，这表明栓线已经插入到大脑前动脉(ACA anterior cerebral artery)与大脑中动脉(MCA middle cerebral artery)的分叉处， 阻塞了大脑中动脉主干的起始部。至此不要再继续插入,插入过深可能会使栓线刺破ACA 并诱发蛛网膜下腔出血(SAH subarachnoid hemorrhage)导致建模失败甚至小鼠死亡。 若栓线插入深度在6mm左右时已感到较大阻力，说明栓线可能过粗无法入颅，或者可能 误插进翼腭动脉，此时不可蛮力插栓，应将栓线稍稍退出更换角度后再尝试插入颈内动 脉的入颅支。11、将栓线插入到指定位置后，把颈外动脉的近心端上所备活结系
7、紧固定栓线。解开阻断 颈总动脉的活结，最后缝合皮肤，以碘伏消毒缝合处，将小鼠放回笼内。12、术后以红外灯照射小鼠保暖并监测小鼠体温，注意笼中保持干燥，无积水或粉尘，防 止小鼠误吸窒息。13、两小时之后，剪开缝线，拔出栓线并结扎颈外动脉断端，恢复小鼠的脑血灌流，然后 重新缝合消毒，将小鼠放回笼内继续监护。14、小鼠醒后参照Bederson等、Zea Longa等人的五级4分评分法对模型进行脑损评分。 0 分：未见神经病学征象，即无神经功能缺损症状；小鼠被提尾悬空时两前肢向地面伸直；置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10cm，手感左右 推动的阻力相等。1 分：轻微神经功能
8、缺损；小鼠被提尾悬空时由于缺血对侧前肢力弱，呈屈曲、抬高 肩部内收，肘关节伸直，同时身体也会转向缺血对侧；置动物于软塑料板上，轻握鼠尾，在 鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10cm，手感左右推动的阻力相等。2 分：中度局灶性神经功能缺损；小鼠爬行时向缺血对侧转圈；置动物于软塑料板上 轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10cm，手感左右推动的阻力不等，缺血对侧的 侧向推动阻力明显降低。3 分：重度局灶性神经功能缺损；缺血对侧肢体不能承受体重，小鼠站立时向缺血对 侧倾倒。4 分：严重神经功能缺损；无自主活动、意识障碍或呈筒样滚动。 选取其中脑损评分为2-3分的小鼠为合格模型，进入后续实验内容。 0-1 分，或无神经功能缺损与轻微神经功能缺损可能是因为对 MCA 的阻塞不够； 4 分，或严重神经功能缺损可 能是因为插栓过深诱发SAH。15、将成功的小鼠模型单独分笼饲养，每日观察记录。
