肿瘤细胞培养

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1、第 6 章 肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重 要手段。癌 细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。应用 体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1) 可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细 胞生命活动得影响。(2) 既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3) 可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。(4) 可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。(5) 研究周期短，比较经济。但就是它也有缺点

2、，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2% 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子,在软琼脂培 养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量 增多时可呈多层重叠 生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。3、永生性永

3、生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞 系(株)都表现有这种特性。但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基 因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生 长增殖能力并不旺盛，有时只能传 若代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。另外，本外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat-110T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。4、侵润性侵润性就是肿瘤细胞扩张性增殖行为.体外培养得肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培 养时，能侵

4、润入其她正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。5、异质性 所有肿瘤细胞都就是由增殖能力、遗传性、尼源、周期状态等性状不同得细胞组成，属 于异质性，其中有得衰老、退化，有得处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖得肿瘤细胞 才就是支持肿瘤生 长得成分，肿瘤下细胞易于生长增殖，分离培养干细胞得方法称干细胞培养 (有干细胞系与数个亚系组成)。6、细胞遗传性失去二倍体核型，呈异倍体或多倍体，常有标记染色体出现,正常细胞与恶性肿瘤细胞得区别，如表6-1 所示。表 61 区别正常成纤维细胞与恶性肿瘤细胞得常用指标指标正常成纤维细胞恶性肿瘤细胞形态棱形或多角形，申展良好，折光 较弱，核浆比例小，嗜碱性弱， 核仁较少

5、较小，多核巨细胞少见多角形或细长形，伸展较差，折 光强，核浆比例大，嗜碱性强， 核仁多、大，常见多核巨细胞生长特性排列有方向性，单层生长，有接 触抑制，饱与密度低方向性消失，多层重叠生长，接 触抑制消失饱与密度髙粘附性细胞间粘附性强，紧贴壁生长细胞间粘附性弱，易脱落血淸得要求必须有血淸无需血淸能生长在半固体琼脂中生长能力不能生长能生长，形成集落电子显微镜观察核蛋白体较少，攵丝微管有规则 排列核蛋白体丰富，微线微管消失细胞膜对低分子物质通透性粘 多糖得合成与分泌腺昔酸环化 斷活性细胞内CAMP浓度低 多咼髙咼少低低对松抱菌素得反应不刺激核分裂，或至多形成双核 细胞核持续分裂，形成多核巨细胞致瘤试

6、验不能形成肿瘤能形成肿瘤二、培养肿瘤细胞得生物学特性得检测体外培养得细胞一旦建立细胞系就需要进行一系列得细胞生物学特性鉴定,其目得在于: 证明培养得 细胞就是否来自原来得肿瘤细胞。说明肿瘤组织类型、描述肿瘤细胞得生物学特性。通常要检查下列项 目：1、组织起源 应说明培养材料起源于哪个胚层、器官组织、什么样供体、何种疾病等,必要时要提供 病理诊断鉴 定资料、2、形态观察 观察细胞一般形态如细胞形状,核浆比例倒宜，有丰富得三极或多极有丝分裂，核仁淸晰、多个, 微丝、微管排列紊乱。3、细胞生长特点 检测细胞生长曲线，细胞分裂指数,倍增时间及细胞周期、癌细胞失去正常得接触抑制，呈多层生 长，生长旺盛,

7、倍增时间缩短，饱与密度大，分裂指数较髙，具无限增殖能力,细胞浸 润能力较强等。4、软琼脂培养 癌细胞在低密度下仍具有髙度存活率，并在软琼脂中形成集落、5、细胞核型分析检测核型特点，染色体数量，有无标记染色体，染色体带型等,癌细胞大多为异倍体，多 倍体，并有标记染色体、6、动物致瘤试验裸鼠背部皮下接种IX 1 0 2X 1 O9/L癌细胞能生长形成实体瘤，K组织学形态与 原发瘤相似。7、组织化学检查 癌细胞中脱氧核糖核酸、酸性磷酸酶与磷脂增多，碱性磷酸酶下降,乳酸脱氢酶与琥珀酸脱氢酶活性也改变。8、英她生物学特性检测有凝集试验等。三、 肿瘤细胞得取材与培养（一） 肿瘤细胞得取材方法 培养肿瘤细胞

8、得材料一般来自患者，对实体瘤患者可取原发肿瘤组织或转移灶,有胸、腹 水患者可 取胸水或腹水，白血病患者可取血液或骨髓液进行培养。1、实体瘤取材方法 取术后或活检标本，要尽早浸入无血清培养液保鲜，尽快进行培养。尽可能去除溃疡及坏死组织，避免细菌、霉菌污染，对取自外露得肿瘤组织，应在培养前在含二性篷素B 2ug/m L清霉素200 1000u/mL,链签素50 0 ug/mL得培养液中浸泡1 02 0分钟，再用洗液反复冲洗干净后，再作培养、2、体腔液得取材方法在无菌条件下采取体腔液（胸水或腹水）,不需加抗凝剂，可直接以1 2 00 r/mi n收集细胞,不要久 置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种、

9、3、血液（骨髓）取材法 白血病患者可取血液或计髓，主要以取外周血为研究对象，用肝素抗凝得注射器无菌抽取510mL外周血，置于试管中立刻分离培养。（二） 肿瘤细胞得培养方法肿瘤细胞对培养基要求不如正常细胞严格，一般常用RPM164 0.DM EM.Mc-Co y 5A等培养 基，血清浓度不髙,10%即可，建议在原代培养时最好能加入生长因子或原患者血淸（ 1%2% ）以利 细胞生长,培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钮网法、脱落细胞法等。原代细胞得培养方法 如下：1、组织块培养法将取得得瘤组织去除脂肪结缔组织及坏死部分，在平皿中用Ilan k s液洗3次，剪碎组织，切成 l2mm3小块，接种

10、于事先涂有鼠屋胶原得培养瓶或皿中,3 tc 5 %或加盖瓶塞在普通恒温箱中培养。2、酶消化法在上述得碎组织块中加入0。25%胰蛋白酶或（200 0 u/ml胶原酶）在3 7C水浴中消化30分钟 （或更长一些） ，去除消化液，用洗液洗3次，培养液洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分 散制成细胞悬液，计数。以5 XIOTOX 1 0几细胞浓度,在含有10%小牛血淸得RPMI1 6 40（或Eagl 亡MEM或DMEM ）中3 7 C 5 % CO:下分瓶（或皿）培养。3、钮网培养法在一张面积约为1 cm得钮网上放入上述剪碎得一块或几块肿瘤组织块（12mm彳大小），用银 子轻压，使其粘于网上，

11、再把锂网放入培养皿中，使网下得组织块与皿壁紧紧接触于3 7C 5% CO:下 培养，每隔23天换液一次,5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净得 单层上皮细胞。3、脱落细胞法 将新鲜得肿瘤组织去除脂肪与结缔组织,洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片,在切割得同时 有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基,便可获得较纯得上层细胞，于培养瓶（或 皿）中、37C 5% CO二下培养，每隔23天换液，71 0天上皮细胞逐渐长成单层、在原代培养中，常在培养物中混有正常成纤维细胞，若把正常细胞误认为就是癌细胞，就 会使整个 工作失去意义，若不及时去除这些成纤维

12、细胞，由于它比肿瘤细胞生长快，最终能抑制肿瘤细胞得生长、 因此,尽早排除成纤维细胞，已成为肿瘤细胞长期培养建系得关键，现已 发现有许多因素能抑制成纤维细 胞生长（见表6 2）。表6 -2 抑制成纤维细胞生长得因素方法因素组织细胞选择性附着胰蛋白酶胚胎小肠、心肌表皮胶原酶乳癌选择性附着底物聚丙稀酰胺各种肿瘤聚四氟乙烯（T e f 1 o转化细胞n）表皮细胞汇合饲细胞层小原3猪皮）表皮人胎小肠正常与恶性乳腺上皮结肠癌选择性培养基D 缄氨誨(V a lin e )肾组织MC DB710乳腺MCDB-153表皮Ph e n obar b i t o ne肝细胞（三）成纤维细胞得排除方法为了在肿瘤细胞中

13、排除成纤维细胞，常采用五种方法，即机械刮除法、反复贴壁法、消化 排除法胶原酶消化法、密度梯度离心法。1、机械刮除法 用不锈钢丝末端得橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插入不锈钢线）或裹上少许脱脂棉制成,装入试管中 高压蒸气灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。程序如下：（1）标记镜下观察，用记号笔在培养瓶（皿）得背而圈下肿瘤细胞得部位。（2）刮除弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶（皿）中，在肉眼或显微镜窥视下,刮除无标记细胞空间。Ha n ks液冲洗12次诜除被刮掉得细胞。（4）加入培养基继续培养，如仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至彻底刮净为止。2、反复贴壁法 根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢得特点，并

14、结合使用不加血清得营养液.把含有两 类细胞得细 胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。方法如下（同贴壁传代）：待细胞生长达一泄数疑后，倒去旧液，用0。25%胰蛋白酶消化后.Ha n k s液洗2次,加入不含 血淸得培养液吹打分散，制成单细胞悬液、（2 ）取三个培养瓶分别编号为A、B、C,首先把细胞悬液接种入A瓶，置温箱中静置培养5 2 0分钟 后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后，慢慢吸出全部培养物，再接种于B瓶中，然后向A瓶中补充 完全培养基巻温箱继续培养。(3 )B瓶中得细胞静宜培养5 2 0分钟后，按处理A瓶得方法，把B瓶中得培养液与细胞悬液吸岀 并注入C瓶中，再向B瓶补加完全培养基,C瓶

15、补加少量小牛血淸(浓度为10%)、三个瓶一并在培养箱中培养，如操作成功，次日观察，可见A瓶中主要为成纤维细胞.B瓶中两类细 胞混杂,C瓶中主要为上皮细胞(癌细胞)，必要时可反复处理几次直至癌细胞纯化为止。3、消化排除法此法曾用于乳癌细胞得培养，具体方法如下：先就是用0。25 %胰蛋白酶与0。02 % EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次，然后加入新得混合 液继续消化直到有半数细胞开始脱落时，立即停止消化。(2 )把消化液离心弃去上淸，沉下得细胞用培养基重悬并吸入另一培养瓶中，置温箱培养, 向原瓶中 补加新得培养基继续培养，此法处理后，鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落,原瓶中留下得多为肿瘤细胞， 经过几次反复处理，就能把成纤维细胞除净。4、胶原酶消化法本法就是利用成纤维细胞对胶原较为敏感得特点通过消化进行选择。(1 )可用0.5mg/mL得胶原酶消化处理边消化边在镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后即终止消 化。(2 )用Hanks液洗涤处理一次后，更换新培养基傩续培养，可获