《磷酸西格列汀一水合物中蛋白质总含量检测》由会员分享，可在线阅读，更多相关《磷酸西格列汀一水合物中蛋白质总含量检测（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、磷酸西格列汀一水合物中蛋白质总含量检测摘要：随着环保要求的提升，生物催化代替化学催化法生产原料药的应用越 来越广，生物催化法涉及的最大问题是总蛋白质含量残留的检测。通过配制一定 浓度范围内的BSA （牛血清白蛋白）标准溶液，测试其吸光度，绘制以浓度-吸光 度标准曲线。将待测样品经预处理后，稀释成一定浓度的溶液，也进行吸光度的 测试，换算出以 BSA 标准牛血清蛋白计算的待测样品中的蛋白质总含量。磷酸西 格列汀蛋白质总含量残留检测方法的定量限、线性、回收率良好。关键词：磷酸西格列汀；水合物；蛋白质含量；检测分析引言：中国药典 2020 年版1和美国药典中，推荐的蛋白质含量测定法有：凯氏定 氮法、
2、LOWRY法、双缩脲法、BCA法、开马斯亮蓝bradford法，紫外可见分光光 度法等。本文作者就 LOWRY 法检测转氨酶法生物催化的磷酸西格列汀一水合物中 蛋白质总含量的方法学验证进行阐述。一、方法原理碱性条件下，PH=10.010.5,蛋白质的肽键和铜离子形成复合物，这时无明 显的颜色变化。加入福林酚试剂（主要成分为磷钼酸、磷钨酸），酪蛋白的酚羟 基被钨钼酸混合性显色剂还原，生成蓝色的还原产物，还原产物在 750nm 处有最 大吸收波长。通过配制一定浓度范围内的BSA （牛血清白蛋白）标准溶液，测试 其吸光度，绘制以浓度-吸光度标准曲线。将待测样品经预处理后，稀释成一定 浓度的溶液，也进
3、行吸光度的测试，换算出以 BSA 标准牛血清蛋白计算的待测样 品中的蛋白质总含量。二、蛋白质总含量限度标准参照注射用肝素钠中蛋白质总含量的限度标准，肝素钠中蛋白质总含量采取LOWRY法检测，要求0.1%，即lOOOppm,磷酸西他列汀的剂型为口服片剂，参 照注射用药，制定 1000ppm 的限度标准，也即 0.1%。三、方法描述溶液配制硫酸铜试液称量约150mg五水硫酸铜和约240mg二水合酒石酸钠到容量瓶 中，用水稀释至50ml，混匀。溶解10g碳酸钠到水中，最终定容至50ml，混匀。缓慢倾注碳酸钠溶液到硫酸铜溶液中，混匀。氢氧化钠溶液溶解3.2g氢氧化钠至水中，用水稀释至100ml。去氧胆
4、酸钠试液溶解5g去氧胆酸钠到水中，用水稀释至100ml。碱性铜试液制备硫酸铜试液、去氧胆酸钠试液和氢氧化钠溶液的混合 物，三者的比例为1:2:1。福林酚试液混合2ml福林酚试剂和10ml水，室温储存于棕色瓶中。稀释剂称取820mg 85%的磷酸于100ml的容量瓶中，用纯化水稀释至刻 度。样品溶液称取约5g磷酸西他列汀一水合物至100ml的容量瓶中，用纯化 水至刻度，摇匀，得到浓度为50mg/ml的磷酸西他列汀一水合物溶 液。样品溶液的预处理移取1ml测样品溶液至2ml的离心管中，加入1ml 4%的氢氧化钠 溶液，摇匀，密封，在14000r/min的离心机上离心10分钟，吸取上 清液0.5ml
5、，放入10ml的离心管，加入纯化水1.5ml。空白溶液纯化水空白溶液的预处理移取1ml纯化水至2ml的离心管中，加入1ml 4%的氢氧化钠溶 液，摇匀，密封，在14000r/min的离心机上离心10分钟，吸取上清 液0.5ml，放入10ml的离心管，加入纯化水1.5ml。空白溶液、样品溶液的检测预处理后的空白溶液和样品溶液，加入2ml碱性酮试液，混匀， 室温静置10分钟。加1 ml稀释的福林酚试液，立即混匀，室温静置 30分钟。在750nm波长下测定吸光度。注意：孵化期间，在20-30分 钟颜色达到最深，之后缓慢变浅。四、方法学验证可接受标准项目可接受标准定量限绘制BSA标准曲线，以紫外分光光
6、度计能准确定量的最低浓度作为蛋 白质总含量测定的LOQ。线性配制1.2512.5 口 g/ml的BSA标准溶液，经处理后，在750nm处测其 吸光度，以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。观察BSA的 线性范围，要求线性相关系数0.99。准确度标准加入法，一定量的样品溶液，分别加入三个不同浓度水平的BSA 标准溶液，经处理后，测其吸光度，扣除样品中总蛋白质的含量，计算回 收率。要求：线性相关系数0.99；回收率：80%120%；1、仪器及试剂、样品仪器列表：电子天平、离心机、紫外分光光度计试剂清单：牛血清白蛋白、福林酚、去氧胆酸钠、三氯乙酸、氢氧化钠、无水碳酸钠、无水硫酸铜、二水合酒石
7、酸钠、磷酸西他列汀一水合物2、溶液配制同三项下“方法描述”中。(1) 稀释剂：称取820mg 85%的磷酸于100ml的容量瓶中，用纯化水稀释至 刻度。(2) BSA标准溶液1的配制配制 BSA 浓度为 1.25 口 g/ml,2.5 口 g/ml,3.75 口 g/ml,6.25 口 g/ml.10口g/ml,12.5口g/ml，的标准溶液，用稀释剂稀释。（3）BSA标准溶液2的配制称取25mg BSA标准品至25ml的容量瓶中，用纯化水定容至刻度，摇匀，作 为BSA标准储备液2，1000 口 g/ml。3、检测步骤同三项下“方法描述”中。五、结果记录1、标准曲线的绘制分别取 BSA 标准溶
8、液 1.2795 口 g/ml，2.559 口 g/ml，3.8375 口 g/ml，6.3975 口g/ml，10.236 口g/ml，12.795 口g/ml，以空白溶液作为参比，测吸光度, 以浓度-吸光度绘制标准曲线。表1不同BSA浓度-吸光度结果记录序 BSA750n扣除号浓度m下空白后口g吸光吸光/ml度（OD）度（OD）1空0.120.000白02 1.0.120.0092795932.0.130.014559443.0.140.0258375556.0.160.042397526 100.180.063.23637120.200.087.7957结论：强制过原点后，线性方程y=0
9、.0066x-0.0008，线性相关系数0.9945。2、定量限绘制 BSA 标准曲线，以紫外分光光度计能准确定量的 BSA 最低浓度为1.2795 口 g/ml，其与样品溶液6.26275mg/ml的浓度比为0.020432%,相当于204.32ppm。3、准确度表 2 加样回收率液名称标准加入值g/ml)得值样品本底OD)(OD测得收率（口均值%g/ml)110.57617.225310体回收率的RSD7.97%，回 收率 平均 值的 RSD值 为 5.34%结论：三个不同水平的BSA加样回收率值均在98.0%120.0%之间，整体回收 率的RSD值7.97%,回收率平均值的RSD值为5.
10、34%，符合方案的接受标准，认 为方法验证有效。4、应用按照上述验证过的方法，连续测定（四）项下的 4批样品溶液，其吸光度值代入1项下绘制的标准曲线，计算样品中蛋白质总含量，报告结果，以ppm计。序溶液测号名称得值扣测得样品蛋白样空白蛋白浓度，残留，ppm030232019030342019030452019(OD)OD)0.0.1180000.0.1500320.0.1490310.0.1520340.0.140022度,697182727545ug/mlNA5.2723.4544.9694.8186.2416256.2473758455535、溶液稳定性配制的试剂试液放置于2C10C的冰箱中，两周内稳定，稀释的福林酚试液临用现配,样品溶液 30min 内完成检测。结束语综上所述，磷酸西格列汀可有效减少B细胞凋亡，促进其再生，导致患者 体内B细胞大量分泌，进一步改善a细胞功能，降低血糖水平。同时磷酸西 格列汀还能缓解患者胃部排空，使患者的基础饮食得到控制，进而控制血脂水平 阿托伐他汀钙可通过减少机体低密度脂蛋白分泌，达到抗压、抗氧化和抗感染的 疗效。参考文献1杨泽敏，王立兵，赵艳平磷酸西格列汀与阿托伐他汀钙联合治疗2型 糖尿病的效果及其对患者血糖、血脂的影响海南医学2018;29(6):850-853
