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1、质粒提取步骤（去除内毒素的kit）准备：挑取单克隆后摇菌12-16小时异丙醇，无水乙醇，1.5毫升无酶EP管，无菌去离子水，涡旋在SOLUTION 1中加入RNASE A保存在4度冰箱DNA WASH buffer中加入无水乙醇，室温保存HBC Buffer中加入异丙醇，室温保存检查SOLUTION 2是否沉淀，若有沉淀，加热到37度溶解N3缓冲液放在冰上热块加热到42度，或者水浴锅，还有一个，加热到70度离心机转速5000XG微凉离心机13000XG步骤：1、摇菌2、收集菌液，5000XG，室温离心，10min3、弃掉上层培养基4、加入500ul SOLUTION 1/RNASE A，涡旋或
2、者抽吸，彻底混匀。重悬完全能获得好的结 果5、转移细胞到新的2ml离心管中6、加入500ul SOLUTION 2，涡旋或轻柔旋转数次，获得澄清裂解液，孵育2-3min,注意 避免用力混合，否则会剪切染色体DNA，降低质粒纯度，不要让裂解液反应超过5min， SOLUTION 2要盖紧，防止空气中的CO2导致其酸化7、加入250ul冰浴预冷的N3 Buffer，轻柔颠倒数次，直到形成白色絮状沉淀（除蛋白） Buffer必须充分混合，如果混合液是粘的，棕色的，成团的，需要更多次混合完全中和 SOLUTION。完全中和绝对影响结果。8、最大转速（大于13000XG），离心10min,形成白色沉淀，
3、迅速进行下一步9、将清澈的裂解有转移到1.5ml EP管，量取清澈的裂解液的体积10、加入1/10的ETR溶液，此时会浑浊，颠倒EP管10次，彻底混匀如果转移500ul清澈裂解液，就加入50ulETR溶液11、冰上孵育10min,在孵育过程中，颠倒混匀数次，冰上裂解后悔澄清，2min/次12、裂解液42度孵育5min,裂解液又会出现浑浊13、25C 12000XG，离心3min,ETR溶液在管底部14、将上层水相转移到一个新的1.5ml EP管中，加入1/2体积无水乙醇，轻柔颠倒6-7次， 室温培养1-2min15、将小柱加入2ml管中，注意：选择性步骤：小柱是否处理16、将700ul混合液加
4、入小柱中17、最大转速（大于13000XG）,离心1min,18、弃去滤液，重新放回19、重复16-18,所有的东西都保存在柱里20、加入500ul HBC Buffer注意加入异丙醇21、最大转速（大于13000XG），离心1min,22、弃去滤液，重新放回23、加入700ul DNA wash buffer注意加入无水乙醇24、最大转速（大于13000XG）,离心1min,25、弃去滤液，重新放回26、重复步骤23-25,27、最大转速空载离心2min,使管干燥，残余乙醇有干扰28、将滤柱放于1.5ml EP管中29、加入80ul洗脱缓冲液或者无酶水，直接加到中间，主要看穿着和穿着的悬液。 DNA的洗脱，主要依赖PH,如果用无酶水，确保PH在8.530、室温下，放置1min31、最大转速离心1min32、重复 29-3133、DNA -20 保存
