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1、小鼠肝线粒体的分离与观察生科三班 2011/5/2实验目的1 了解提取线粒体的基本原理及其过程，掌握差速离心法分离细胞器。2 通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态。3 巩固普通染色步骤及注意事项。实验原理线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功 能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。正由于这样，对线粒体膜，呼吸链 酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生 物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少 的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和 组织的细胞中，大量置备线粒体
2、就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时 (如电镜和光镜的观察)可采用从组织培养细胞中提取。本实验是介绍从小鼠肝 细胞中提取线粒体并在光镜下观察的方法。线粒体(mi to chondria )是真核细胞特有的，是能量转换的重要细胞器。 细胞中的能源物质脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷 酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离 体的线粒体上进行的。制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心。在一给定的离心场 中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮 介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内食物，由
3、于沉降速度 不同将停留在不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其 大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞 核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可一次再分离。悬浮介质通常用 缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构 和酶的活性，在PH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整 个操作过程注意使样品保持4C,避免酶失活。本实验用的是Ringer缓冲液作 为悬浮介质。线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法，詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体 专一的活细胞染料毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，
4、由此吸引堆积在线 粒体膜上，线粒体cell色素氧化酶，使该料保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而 使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。实验器材材料：小鼠试剂：生理盐水、1%詹姆斯绿B染液，用生理盐水配制、Ringer缓冲液。实验步骤1 用断头法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取出肝脏，选取边缘较薄的肝组织0.5cm3放入小烧杯中，用Ringer液冲洗去血污。2滴加1/5000詹纳绿B溶液于双凹片的凹穴中，再将上述洗净肝组织移入染液， 染色2030min，以组织块边缘被染成蓝绿色为准。注意，染色时要使组织块上 面部分半露在染液外，不可完全淹没，以便使线粒体酶得到氧化。3吸去染液，将肝组织重置小
5、烧杯中，滴加Ringer溶液0.5ml，即溶液刚好将 肝组织浸没，用剪刀将组织充分剪碎制悬液。4 取上述细胞悬液滴片，加盖玻片，高倍镜下观察结果，肝细胞质中的线粒体被 染成蓝绿色。实验结果红细胞线粒体分析讨论如图所示，线粒体呈淡蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。线粒体被詹姆斯绿染液染成 蓝绿色，而其他细胞器及细胞质不被着色，线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持 氧化状态（即有色状态）呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状 态。颜色较深的圆形的为红细胞，由于肝脏中血液丰富，在提取线粒体时，红细 胞未除净，出现在视野中。操作中应该注意的问题1. 整个操作过程为保证线粒体的完整，应尽量使操作时的环境如温度（04C）, pH （7.0左右）保持恒定，同时尽可能短操作时间。2. 组培细胞消化时要特别小心，防止损失或反复。（损失指细胞脱落到消化液 中）。3. 匀浆时，所用的介质一定是等渗缓冲液，常用的有0.25 mol/L蔗糖溶液或 生理盐水代替Hanks液4. 匀浆次数依照匀浆器的松紧而定，次数过少，细胞破损不完全，就会影响线 粒体产量。5. 所以取2/3上清夜用来制备线粒体是为防止细胞碎片过多影响观察。6整个分离过程，一般最好在 3060 分钟内完成，不宜过长。
