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1、小鼠基因组提取与基因型鉴定一小鼠基因组提取1试剂与纯化柱试剂货号口 0A 品牌BufferAL19075QIAGENBufferAWl19081QIAGENBufferAW219072QIAGEN蛋白酶K1256380100默克自配裂解液纯化吸附柱PK127-B天根2.方法2.1 剪0.4- 0.6 CM鼠尾，切成小块，装进1.5mlEP管中，加300ul裂解 液.（自配的裂解液，配方见下表）2.2 加入10ul蛋白酶K,充分混匀，56C过夜（约16个小时）,或加入30ul蛋白 酶K,充分混匀，56C2h。2.3 尾巴完全裂解后，取出，充分混匀，直至混液成均匀且无结块，向管内 加入50ul B
2、uffer AL,充分混匀。然后加入200ul无水乙醇，充分混匀（用手上下颠倒混匀，动作不宜过猛，防止DNA断裂）。24 将上述混合液加入到装有2ml收集管的柱子中，12000rpm离心lmin，倒 掉废液，将柱子放回收集管。25 向柱子中加入 250ul Buffer AW1，静置 2-3min， 12000rpm 离心 lmin，倒 掉废液，将柱子放回收集管。26 向柱子中加入 250ul Buffer AW2,静置 2-3min， 12000rpm 离心 1min，倒 掉废液，空离2min。注意：此步拿柱子时不要碰到收集管中的液体。27 将柱子放到一个干净的1.5ml离心管中，开口放15
3、min左右，（残留的液 体蒸发干，残留的乙醇对PCR有影响）（有条件的可放在安全柜中通风 吹干 10-15min）2.8 向柱子中心慢慢滴加 200ul 无菌去离子水。室温静置 3min， 12000rpm 离心2min，为增加基因组DNA的回收率，可将离心得到的溶液再加入吸 附柱中，室温放置 2min， 12000prm 离心 2min。小鼠基因组裂解液的配制（1000ml为例）所需样品成分比例应加样品量尿素4M240.24gEDTA-2Na-2H2O10mM3.722gSarcosyl （十二烷 基肌氨酸钠）0.5%5gTris/HC1(1M,PH8.O)0.1M100mlNaCl0.2M
4、11.688g去离子水补足至1000ml二小鼠基因型鉴定1.基因型鉴定方法：采用PCR检测方法，以确定小鼠为纯合子/杂合子/野生型1.1 引物引物对及扩增片段大小引物对序号123引物对Pw/P10A-W-up/B-HO-up/C-WH-downNeo P3/P10纯合子条带大小2628bp1533bp1154bp杂合子条带大小2628、1533、 1726bp1154bp724bp野生型条带大小724bp1726bp无条带引物序列（5今3）引物名称序列P10GCTTGCTCCGGTGAGTCCTGTTGPwCATTCAGGGTGCAGGCACCATCACCATGCNEO-P3CTGAGCCCA
5、GAAAGCGAAGGAA-HO-UPTGGACGTAAACTCCTCTTCAGACB-WH-DOWNGATTTGGCAGACTTGGCTCTC-W-UPTGCCTGTAGGTTGGTTCCTTGTGGATTG1.2 引物稀释方法1）100gM储存液：先把合成好的引物粉末置于离心机中于12000转离心3- 5min,之后取出并小心打开盖子，加入一定量微摩的水吹打混匀，然后瞬时 离心（注加入管内的去离子水为管壁上总 nmole 数乘以 10）2）10pM的使用液：将储存液稀释10倍，上下引物稀释到同一个管中，引物 不要反复冻融，分装保存于-20C。1.3 PCR反应体系：总体系15ul引物1引物
6、 2/3PCR MIX8卩1PCR MIX8卩1引物10.6卩1引物 2/31.2卩1模板0.3u1模板0.6卩1去离子水6.1 卩1去离子水5.2卩11.3反应条件95C5min； 95C30s, 63C30s，72C3min 共 30 个循环；72C10min； 12C8。1.4琼脂糖凝胶电泳PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为8ul,电压为100-150V。1.5 数据处理与结果分析用 Adobe Photoshop 7.0 软件把样品标号标记在琼脂糖凝胶电泳图片上，样 品 PCR 产物条带与纯合子、杂合子、野生型 PCR 产物条带做比照，以确定 样品为纯合子、杂合子或野生型。本试验只取纯合子小鼠颌下腺用于后续蛋 白提取。
