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1、酶工程与药用酶的研究进展.【完整版】(文档可以直接使用，也可根据实际需要修订后使用,可编辑放心下载）酶工程与药用酶的研究进展程庆佳云南大学，生命科学学院，生物技术，20211070004摘要：本文介绍酶工程与药用酶近年来的研究进展，其中包括分子酶工程，化学酶工程，生物酶工程，药用酶近年来的研究和一些最新的药用酶介绍。英文摘要：This article describes the Enzyme engineering and pharmaceutical enzymes research in recent years, including the molecular enzyme engine
2、ering, chemical enzyme engineering, enzyme engineering, pharmaceutical enzymes in recent years some of the latest medical research and enzyme introduction.关键词：分子酶、化学酶、生物酶、药用酶英文关键词：Enzyme molecules, chemical enzymes, enzymes, medicinal enzyme酶工程是现代生物技术的重要组成局部，它作为一项高新技术将为工业的开展起重要推动作用。其主要任务是通过预先设计，经人工操
3、作而获得大量所需的酶，并利用各种方法使酶发挥其最大的催化功能，它的应用范围已普及工业、农业、医药卫生行业、环保、能源开发和生命科学等各个方面。药用酶是酶工程开展的一个重要标志，它是全球重点研究的酶工程方向，代表着一个新时代的来临，正广泛地应用于制药产业中。1、分子酶工程的研究进展分子酶工程学就是采用基因工程和蛋白质工程的方法和技术研究酶基因的克隆和表达、酶蛋白的结构与功能的关系以及对酶进行再设计和定向加工，以开展更优良的新酶或新功能酶。11酶分子的定向改造和进化分子酶工程设计以采用定点突变和体外分子定向进化两种方式对天然酶分子进行改造。外定向进化是近几年新兴的一种蛋白质改造策略，可以在尚不知道
4、蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。此目前采用体外分子定向进化的方法来改造酶蛋白的研究越来越多，并已在短短几年内取得令人瞩目的成就易错PCR和DNA改组就是其中2种方法。12融合蛋白与融合酶蛋白质的结构常常可以允许某个结构域的插入与融合。DNA重组技术的开展与应用不同基因或基因片段的融合可以方便地进行。融合蛋白经适宜的表达系统表达后即可获得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白。目前，融合蛋白技
5、术已被广泛应用于多功能酶的构建与研究中并已显现出较高的理论及应用价值。随着基因组、后基因组时代的到来和重组酶生产技术的开发。必将会有大量的、新的酶蛋白被人类发现。13酶的人工模拟模拟酶是根据酶作用原理用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。它们一般都具高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶简单；由于不含氨基酸，其热稳定性与pH稳定性都大大优于天然酶。目前用于构建模拟酶的模型有环糊精、冠醚、卟啉抗体酶和分子印迹等。2、生物酶工程生物酶是具有催化功能的蛋白质。象其他蛋白质一样，酶分子由氨基酸长链组成。其中一局部链成螺旋状，一局部成折叠的薄片结构，而这两局部由不折叠的氨基酸链连
6、接起来，而使整个酶分子成为特定的三维结构。生物酶是从生物体中产生的，它具有特殊的催化功能，例如高效性、专一性、易变性失活等。生物酶工程是在化学酶工程根底上开展起来的，是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，也可称为高级酶工程。21酶基因的克隆和表达酶基因的克隆和表达技术的应用使克隆各种天然的蛋白基因或酶基因成为可能，其步骤是：先在特定的酶的结构基因前加上高效的启动基因序列和必要的调控序列，再将此片段克隆到一定的载体中，然后将带有特定酶基因的上述杂交表达载体转化到适当的受体细菌中，经培养繁殖，再从收集的菌体中别离得到大量的表达产物。一些来自于人体的酶制剂，如治疗血栓栓塞病的
7、尿激酶原，就可以用此法从大量的人尿中提取心3。此外还有组织纤溶酶原激活剂(TPA)与凝乳酶等100多种酶基因已经克隆成功，其中一些还已进行了高效的表达。对各种酶基因的克隆和表达，大局部是基于多聚合酶链式反响(PCR)技术、组织培养技术和蛋白质组学的开展。PCR技术自从1985年问世以来已成为基因工程中最重要的技术，它具有高度的专一性和灵敏度，能快速简便地扩增特定的DNA片段。目前PcR技术与其他技术相结合的研究异常活泼，特别是其与差异表达基因克隆技术的结合，产生了一批高效酶基因克隆与表达技术。其在别离克隆新出现的表达基因方面具有明显优势，但仍存在一些缺点，近些年针对这些缺点出现了较大改良，并提
8、出了新的策略与方法。近几年，由于长距离PcR扩增技术与消减杂交技术结合，使此技术获得了较大进展，随着PCR技术的优化和基因工程的开展，酶基因克隆与表达技术将不断开展，而且将会获得更多的新酶工程菌。22酶的遗传修饰酶的选择性遗传修饰，即酶基因的定点突变，酶工程设计可以采用定点突变和体外分子定向进化2种方式对天然酶分子进行改造。定点突变需要知道酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点。体外分子定向进化是近几年新兴的一种蛋白质改造策略，可以在尚不知道蛋白质的空间结构或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组
9、和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。定点突变技术只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构根本维持不变，因而对酶功能的改造较为有限。同时，由于已有的结构与功能相互关系的信息远远不能满足当今人们对蛋白质新功能的要求，因此目前采用体外分子定向进化的方法来改造酶蛋白的研究越来越多，并已在短短几年内取得了令人瞩目的成就。DNA改组那么是1994年由美国的stemmer提出的，这种方法不仅可以对从随机突变文库中筛选出来的一组突变基因人为进化，还可以将具有结构同源性的几种基因进行体外重组，共同进化出一种新的蛋白质。通过这
10、种方法产生的多样性文库可以有效积累有益突变，排除有害突变和中性突变，同时也可实现目的蛋白质多种特性的共进化。23酶的遗传设计酶遗传设计的主要目的是创制优质酶，用于生产昂贵特殊的药品和超自然的生物制品，以满足人类的特殊需要。目前的关键问题在于如何设计超自然的优质酶基因，即如何给出优质酶基因的遗传设计蓝图。现在还不可能根据酶的氨基酸序列预言其空间结构，但随着计算机技术和化学理论的开展，酶或其他大分子的模拟在精确度、速度及规模上都会得到改善，这将导致有关酶行为的新观点或新理论的产生，酶的化学修饰及遗传修饰也将提供更新的实验依据及数据，有助于解决关于酶的结构与功能的关系，因而将促进酶的遗传设计的开展。
11、3、化学酶工程化学酶工程亦称为初级酶工程，它主要由酶学与化学工程技术相互结合而形成。31 自然酶制剂的开发与应用自然界中存在的酶有7 000种左右，其中经过鉴定和分类的有2 000余种，但大规模生产和应用的商品酶只有数十种，小批量生产的商品酶约数百种。目前，已应用于工业生产的酶主要有水解酶、凝乳酶、果胶酶、糖苷酶、氧化酶、转移及异构酶等，当前酶的应用研究备受关注，主要有以下几个方面：食品工业中的应用。酶在食品工业中最大的用途是淀粉加工，其次是乳品加工、果汁加工、食品烘烤及啤酒发酵。与之有关的各种酶如淀粉酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶、凝乳酶、蛋白酶等占酶制剂市场的一半以上。能源开发上的应用。在全世界
12、开发新能源的大趋势下，利用微生物或酶工程技术从生物体中生产燃料也是人们正在探寻的一条新路。例如，利用植物、农作物、林业产物废物中的纤维素及半纤维素等原料制造甲烷等气体燃料以及乙醇和甲醇等液体燃料。另外，在石油资源的开发中，利用微生物作为石油勘探、二次采油、石油精炼等手段也是近年来国内外普遍关注的课题。环境工程上的应用。在现有的废水净化方法中，生物净化常常是本钱最低而且最可行的。微生物的新陈代谢过程可以利用废水中的某些有机物质作为所需的营养来源，因此利用微生物体中酶的作用，可以将废水中的有机物质转变成可利用的小分子物质，同时到达净化废水的目的。医药行业上的应用。药用酶、抗体酶和酶标药物的研究开发
13、及新型的溶栓酶、艾滋病毒蛋白酶等的研究备受关注。另外位于真核细胞染色体末端由重复DNA序列和蛋白质组成的端粒与细胞的寿命和癌变有密切关系，端粒酶在端粒中起着重要的催化作用，有关端粒的结构和端粒酶的催化机制的研究已经成为自然酶的研究热点之一。但迄今为止，人们对极端环境微生物和不可培养微生物的研究还很不够，这2个资源宝库值得人们好好开发。目前，研究人员完全可以绕开菌种别离、纯化步骤，应用最新分子生物学方法，直接从这类微生物中探索、寻找有开发价值的、新的微生物基因和新的酶种。32酶的化学修饰酶的化学修饰是指利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子的某局部去除或置换，改变酶的理化性质
14、，最终到达改变酶的催化性能的目的。酶的化学修饰主要有以下几种方法：修饰酶的功能基团，如氨基、羟基、咪唑基等可离解基团，由此开展起来的方法有酰化法、烷基化法、丹磺酰氯法等。例如，抗白血病药物天冬酰胺酶n4J经修饰后，可使其在血浆中的稳定性提高数倍。酶分子内或分子问交联，应用某些双功能试剂分子两端的功能基团(如醛基等)可使酶分子内或分子间肽链的2个游离氨基分别发生交联，主要有右旋糖苷溴化氰法、羰二亚胺法、戊二醛法等。例如，交联后的a一半乳糖苷酶A，其热稳定性和抗蛋白酶的性能都有明显提高。酶与高分子化合物结合，主要有聚乙烯醇法、聚顺丁烯二酸酐法等。酶与高分子化合物结合后，可以增加酶的稳定性，例如，a
15、一淀粉酶在65时半衰期为25 rnin，当其与葡萄糖结合后，半衰期延长至63 rnin。酶的化学合成和化工过程几乎都在有机溶剂中进行，而有机溶剂往往被认为会引起酶的失活，但经化学修饰的酶能催化有机相中的反响，特别是在对映体选择降解、非对映体裂解和手性化合物的合成与拆分方面，化学修饰酶显示了巨大的威力。33酶的固定化固定化酶是指被结合到特定的支持物上并能发挥作用的一类酶，是化学酶工程中具有强大生命力的主干。它在理论上和应用上的巨大潜力吸引了生物化学、微生物学、医学、化学工程、高分子等各个领域研究人员的注意力。酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合及包埋4种方法。固定化酶在工业、临床、分析和环境保
16、护等方面有着广泛的应用，但是在大多数情况下，酶固定化以后会局部甚至全部失去活性。一般认为，酶活性的失去是由于酶蛋白通过几种氨基酸残基在固定化载体上的附着造成的。由于酶蛋白多点附着在载体上，引起了固定化酶蛋白无序的定向和结构变形的增加。近年来，国外的研究者们在探索酶蛋白的固定化技术方面已寻找到几条途径，使酶蛋白能够以有序方式附着在载体的外表，实现酶的定向固定化，而使酶活性的损失降低到最小程度。这种有序的、定向固定化技术已经用于生物芯片、生物传感器、生物反响器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究中。34人工合成酶的研制和模拟酶人工合成的具有类似酶活性的高聚物称之为人工合成酶。人工合成酶在结构上必须具有2个特殊部位，即一个是底物结合位点，一个是催化位点。业已发现，构建底物结合位点比拟容易，而构建催化位点比拟困难，2个位点可以分开设计，但是如果人工合成酶有一个
