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1、温度对黑线仓鼠氧化应激、抗氧化水平和解偶联蛋白表达的影响 周思思导师：赵志军教授温州大学生命与环境科学学院，浙江温州，325027摘要：根据自由基的假说，高代谢率应该会增加活性氧(ROS)的产生。然而，“解偶联生存假说认为解偶联蛋白UCPs可以通过降低线粒体内膜的势能减少ROS的产生，在这种情况下，代谢速率和ROS的产生之间的关系将是负相关而不是正相关。在本研究中，我们研究黑线仓鼠能量摄入、氧化应激水平、抗氧化活性，以及褐色脂肪组织(BAT)、肝脏、心脏、骨骼肌和大脑解偶联蛋白的表达。将黑线仓鼠驯化于5和32.5的环境，而对照组饲养在室温下 (21C)。相对于对照组，在5C环境中驯化的黑线仓鼠
2、能量摄入增加了70.7%，而在32.5C环境中驯化的黑线仓鼠能量摄入减少31.3%。相对于对照组，在5C环境中驯化的黑线仓鼠的丙二醛MDA水平、总抗氧化能力T-AOC和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX在BAT中显著降低。相对于对照组，在5C环境中驯化的黑线仓鼠的UCP1在BAT中的表达显著上升，而在32.5C环境中显著下降。在5C环境中驯化的黑线仓鼠其UCP3在骨骼肌的表达也大幅上升。这些结果说明，活性氧的产生和代谢率之间的关系是负相关，而不是正相关。关键词：抗氧化剂；褐色脂肪组织(BAT)；氧化应激；黑线仓鼠；温度；解偶联蛋白Effect of temperature on oxidative
3、 stress, antioxidant levels and uncoupling protein expression in striped hamstersAuthor: Zhou Sisi Tutor: Zhao Zhijun (College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou Zhejiang, 325027)Abstract:In line with living-free radical hypothesis, higher metabolic rates should subjoinr
4、eactive oxygen species (ROS) production. But, the “uncoupling survival hypothesis postulates that uncoupling proteins (UCPs) by decreasing mitochondrial membrane potential to reduce the production of ROS, in this case, the relationship between metabolic rate and ROS production will be a negative cor
5、relation between rather than positive. In this research, we investigated energy intake, the expression levels of oxidative stress, antioxidant activity, and brown adipose tissue (BAT), liver, heart, skeletal muscle and brain uncoupling protein.Key words:Antioxidants; Brown adipose tissue (BAT); Oxid
6、ative stress; Striped hamster; Temperature; Uncoupling proteins一、背景介绍自由基理论认为细胞的代谢过程离不开氧的存在，生物氧化的过程是细胞获得能量的过程。自由基理论把衰老与代谢联系起来，并认为呼吸代谢氧化磷酸化过程中产生过多的自由基对生物体大分子物质的氧化损伤会加速衰老的进程，从而减短了寿命。其中最主要的是活性氧ROS水平。因为高ROS水平会增强氧化来损伤生物大分子如蛋白质、脂质及DNA，因此高ROS水平被认为是减少预期寿命的原因。然而有关对鸟类的研究说明，有些物种的代谢率越高其寿命反而越长。此外，与保持在室温下的小鼠相比，暴露在
7、相对低温情况下的小鼠其代谢较高并且寿命也较长。对于代谢率与ROS产生的关系，在一些研究中发现这两者之间是存在着明显的负相关，对其的一个可能的解释是“解偶联求生存假说。该假说提出，解偶联蛋白降低ROS的产生，通过降低线粒体内膜的电位来实现的。UCPs是线粒体膜上的转运蛋白，迄今为止，在哺乳动物体内已发现5 种UCPs：UCP1 主要分布在褐色脂肪组织中；UCP2能在白色脂肪组织、骨骼肌和免疫系统等多种组织中出现；UCP3主要存在于骨骼肌和脂肪组织里。UCP4和UCP5主要在大脑和肝脏中出现。UCP1调节机体产热，可介导任意食物诱导的产热。UCP2因为具有质子漏功能，而减少了线粒体ROS(活性氧产
8、物的产生。UCP3 有较强的减少ROS的产生和从线粒体基质中输出脂肪酸阴离子或脂质过氧化产物的能力，这样可以进一步减少氧化应激等。总的来说，UCPs能控制线粒体内ROS 生成，与氧化应激等过程也有密切联系。“解偶联求生存假说预测，暴露在寒冷环境下动物的组织应该会降低ROS的产生而解偶联蛋白的表达量会增高。但是一些研究结果并不符合解偶联生存假说，比方暴露在寒冷环境下大鼠的肝脏、心脏和骨骼肌中过氧化氢H2O2水平增加，暴露在寒冷环境下短尾田鼠的肝脏和肌肉组织蛋白质羰基水平显著增加。我们设计实验来测定温度对黑线仓鼠的代谢率、氧化应激、抗氧化水平和mRNA的表达的影响。先前的一个研究发现，暴露在适度寒
9、冷或气温相对温和的环境中，对黑线仓鼠氧化应激和抗氧化水平并没有造成显著变化。当前研究的目的是测定温度对黑线仓鼠代谢率、氧化应激和抗氧化水平的影响，以及与“解偶联求生存假说关系。二、实验材料本实验所使用的黑线仓鼠来自于河北省的农田 (11513E, 3812S)，被饲养于温州大学。黑线仓鼠被单独安置在装有适量锯末的塑料笼子里(29 15 18 cm)，定期更换干净的锯末并且清理笼子；保证黑线仓鼠有充足的食物(北京科奥饲料的标准啮齿动物食物)和水。实验前所有动物都安置在211C温度的环境中。成年仓鼠3.5 到4.5个月的年龄，随机分成3组，低温驯化组51C (n = 9)和温暖气温驯化组32.51
10、C (n = 8)，对照组保存在室温下(211C)(n = 8)，分别饲养6周。所有动物的体重和食物摄入量是每两天测量一次并且及时记录数据。温度处理结束后，对各个组的组织样品进行收集与保存。三、实验方法3.1总能量摄入(GEI)，消化能量摄入(DEI)和消化率在实验的最后两天对总能量摄入，消化能量摄入进行测定。将每个笼子中剩下的食物以及从木榍中挑出黑线仓鼠的粪便分别装好，并且将黑线仓鼠的粪便置于60C的烘箱中烘干并且测量记录数据。食物和粪便的总能量用氧弹量热计测定。总能量摄入(GEI)，消化能量摄入(DEI)和消化率计算使用以下方程：总能量摄入(kJ/d) = 食物摄入量(g/d) 饲料的干物
11、质含量(%) 食物碎屑 食物总能量含量(kJ/g)；消化能量摄入(kJ/d) =总能量摄入 粪便干质量(g/d) 粪便的总能量含量(kJ/g)；消化率 (%) =消化能量摄入/总能量摄入 100%3.2氧化应激标记物和抗氧化酶实验材料的提取，采用断颈法取血，将黑线仓鼠处死，快速取其肩胛间的褐色脂肪组织BAT，腿部骨骼肌、肝脏、心脏和大脑，并且将这些实验材料储在液态氮中迅速冷冻，以保证实验材料的活性。组织的处理方式：按照一定的质量配比将组织放置到冰冷的0.9%的氯化钠溶液中进行匀浆，然后再放到离心机中用3000转的转速对其进行离心，15分钟后取其上清液保存在适宜的环境中待后续实验分析。用Lowr
12、y法测定蛋白质浓度。使用(南京建成生物工程研究所)生产的试剂测定过氧化氢H2O2水平，并通过对过氧化氢水平的测定来分析分析黑线仓鼠的氧化应激水平。过氧化氢405nm的水平表示为毫摩尔/克蛋白质mmol/g protein。 丙二醛(MDA)作为脂质过氧化反响的指标。MDA是脂质过氧化反响的最终产物，用硫代巴比妥酸TBA在532nm波长进行测定，并且产生具有粉红色的产物。组织MDA水平表示为纳摩尔/克蛋白质nmol/mg protein。3.3总抗氧化能力T-AOC和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX活性使用(南京建成生物工程研究所)生产的试剂测定T-AOC和GSH-活性。在之前的大量预实验研究中证
13、实这些试剂都适用于黑线仓鼠。黑线仓鼠机体中有许多抗氧化物质，能使3价的Fe复原成2价的Fe，后者可与菲啉类物质形成稳固的络和物，通过比色可测出其抗氧化能力的上下。在测定过程中，将待测液按一定要求处理后用双蒸水调零1cm光径，520nm测各种管吸光度。定义：在37时，每分钟每毫克待测液，使反响体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。在GSH-PX活性测定的根底上复原谷胱甘肽GSH，过氧化氢产生氧化型谷胱甘肽GSSG和H2O反响。GSH与二硫化碳代2硝基苯甲酸DTNB反响产生2-硝基-5-硫代苯甲酸，可以在412nm处被检测的黄色化合物反响。谷胱甘肽过氧化物酶活性的一个单位
14、，在37下限定为1微摩尔GSH消耗/分钟/ 毫克蛋白质。3.4实时RT-qPCR的分析荧光定量PCR分析使用Trizol试剂TAKARA，中国大连。提取褐色脂肪组织、肝、心脏、骨骼肌和脑组织总RNA，用分光光度计测定的吸光度值确定RNA样品浓度，然后调节到一致水平。取用调整过浓度的总RNA样品2L，用MLV反转录酶TAKARA和oligodT18引物进行cDNA的合成，反响体系为50L。用2L的cDNA样品作为模板，使用解偶联蛋白目的基因的特定引物进行PCR反响表1。表1：用基因特异性引物序列测定实时RT-QPCR来分析解偶联蛋白在黑线仓鼠中的表达。Table 1. Gene-specific
15、 primer sequences used for Real-time RT-QPCR analysis of uncoupling protein (UCP) expression in the striped hamster.Gene Primers (5to 3)Size (bp)UCP1 (forward)GGGACCATCACCACCCTGGCAAAAA330UCP1 (reverse)GGCTTTCTGTTGTGGCTATUCP2 (forward)GCTGGCGGTGGTAGGAGAT208UCP2 (reverse)TGAAGTGGCAAGGGAGGTUCP3 (forward)ATGGATGCCTACAGAACC90UCP3 (reverse)GACAATGGCGTTTCTCGTUCP4 (forward)GCCGAATAATGAACCAAC150UCP4 (reverse)ACCAAGGGGTCATTCTCAUCP5 (forward)TGCCTTGTTCCGAATCTA191UCP5 (reverse)AATCACTCCTGACACTACCCActin (forward)AAAGACCTCTATGCCAACA196Actin (reverse)ACATCTGCT
