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1、实验九凝胶层析分离蛋白质一 实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质二 实验原理凝胶层析也称凝胶过滤、凝胶过滤层析、分子排阻层析和分子筛选层析。凝胶是具有一定孔径的网状结构物质，凝胶层析是一种分子筛选效应，主要用于分离分子大小不同的生物分子以及测定其相对分子质量。相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进入凝胶颗粒内部，而相对分子质量大的物质不能进入凝胶内部，被排阻在凝胶颗粒外，随着洗脱的进行，相对分子质量小的物质由于进入凝胶内部，不断地从一个网孔穿到另外一个网孔，这样“绕道”而移动，走的路程长，下来得慢（迁移速度慢），而相对分子质量大的物质不能进入凝胶内部即随洗脱液从凝胶颗粒
2、之间的空隙挤落下来，走的路程短，下来的快（迁移速度慢），这样就可以达到分离的目的。三 实验器材1. 层析柱1cmX90cm2. 恒流泵。3. 紫外检测仪。4. 部分收集器5.记录仪6.试管等普通玻璃皿四 实验试剂1. 待分离样品：胰岛素、牛血清蛋白。2.葡聚糖凝胶sephadexG-753.蓝色葡聚糖20004.洗脱液：01.mol/L,PH6.8磷酸缓冲液五 实验方法1.凝胶的处理sephadexG-75干粉经蒸馏水室温充分溶胀24h,或沸水浴中3h,这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和排除凝胶内部的气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎。凝胶颗粒大小要求均匀,使流速稳定凝胶充
3、分溶账后用倾泌法将不易沉下的较细的颗粒除去。将溶胀后的凝胶抽干,用10倍体积的洗脱液处理约lh,搅拌后继续用倾泌液除去悬浮的较小的细颗粒。2. 装柱将层析柱垂直装好,关闭出口,加入洗脱液约lcm高。将处理好的凝胶用等体积洗脱液搅成浆状,自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中,待底部凝胶沉积约lcm高时,再打开出口,继续加入凝胶浆,至凝胶沉积至一定高度（约70cm）即可。装柱要求连续,均匀,无气泡,无“纹路”。3. 平衡将洗脱液与恒流泵相连,恒流泵出口端与层析柱入口相连,用2-3倍床体积的洗脱液平衡,流速为0.5ml/min。平衡好后在凝胶表面放一片滤纸,以防加样时凝胶被冲起。柱装好和平衡后可用蓝色葡聚糖
4、2000检查层析行为,在层析柱内加1ml（2mg/m蓝色葡聚糖2000然后用洗脱液进行洗脱（流速5ml/min），若色带狭窄并均匀下降，说明装柱良好，然后再用2倍床体积的洗脱液平衡。4. 加样与洗脱将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将lml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，用少量洗脱液洗柱内壁2次，加洗脱液至液层4cm左右，按上恒流泵，调好流速（0.5ml/min），开始洗脱。上样的体积，分析用量一般为床体积的1%2%，制备用量一般为床体积的20%30%。5. 收集与测定用部分收集器收集洗脱液，每管4ml。紫外检测仪280nm处检
5、测，用记录仪或将检测信号输入色谱工信站系统，绘制洗脱曲线。6. 凝胶柱的处理一般凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（23倍体积）即可，若凝胶有颜色或比较脏，需用0.5mol/LNaCl洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放2个月无长霉情况，但在夏季如不用，则要加0.02%的叠氮钠防腐。六 注意事项装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀。凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。样品的浓度和加样量的多少。是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%-2%，制备用量一般为柱床体积的20%-30%。凝胶用完后可再加入防腐剂低温保存。叠氮钠属于有毒性物质，在使用过程中需注意安全。七 思考题1对于蛋白质的分离纯化，目前研究使用较多的还有哪些方法？2凝胶层析的主要原理是什么？3装柱的要点有哪些？怎样检查柱是否装的均匀？影响分离效果的主要因素有哪些？
