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1、质粒载体的构建摘 要:质粒载体的构建。一方面要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物,为提高目的基因产率，采用两次CR的措施，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增,进而加尾连接到T-DNA上，再运用电转化的措施将连接产物转化到带有PMBIA131的D5感受态细胞中复制体现。核心词: 质粒 DA PCR 电泳 感受态 转化 1. 引言质粒（plasid)是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的,与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： 是染色质外的双链共价闭合环形DN(cccN），可自然形成超螺旋构造,不同质粒大小在2300kb之
2、间,15kb的小质粒比较容易分离纯化,1b的大质粒则不易提取。 能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒NA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后裔。 质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有助于宿主细胞的特定条件下生存,例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒,带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。因此质粒对宿主不是寄生的,而是共生的。目前分子生物学使用的质粒载体都已不是本来细菌或细胞中天然存在的质粒,而是通过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了多种不同的类型的质
3、粒载体。质粒载体pBR32是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pB322中的“p代表质粒;“R”代表两位两位研究者Boiva和Rogerus姓氏的字首,“32”是实验编号。 质粒载体pB322的大小为4361b,相对分子质量较小的是它第一种长处。长处之二是它带有一种复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因,可供转化子的选择标记是它的第三个长处。质粒载体BR22的第四个长处是具有较高的拷贝数,通过氯霉素扩增后来，每个细胞中可累积10-0份拷贝,该特性为重组体DNA的制备提供了极大的以便。构建质粒载体所用的措施基本上是
4、分子克隆技术,是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定NA片段的措施。常具有目的基因，用体外重组措施将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 2. 材料措施21目的A的获得 2.1. 引物设计第一次引物设计: 正向引物： sinF 冰盒标注：2a 引物序列：5 GCAAAATCTCCTGTAAA 引物长度：5b 反向引物：sinn3R 冰盒标注:P2b 引物序列：5 GCAAAGCGTCTTGTAGTTA3 引物长度:22bp第二次引物设计(带
5、酶切位点）： 正向引物:n3F 冰盒标注:P2c 引物序列:5 CTGTCC AGAAAATTAACGTGTAAGA 引物长度：3bp 反向引物：nn3RE 冰盒标注:P2 引物序列:5TACTGCAGCATAACCAAAGAACGTTTCT3 引物长度：34p2.2 PCR扩增 .2 PR技术的基本原理PCR即聚合酶链式反映,是指在DNA聚合酶的催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、延伸、复性等环节，体外复制出与母链模板DNA互补的子链N的过程.是一项NA体外合成放大技术,可用于基因分离克隆,序列分析，基因体现调控,基因多态性研究等许多方面. P反映五要素: 参与PCR
6、反映的物质重要有五种即引物、酶、dNTP、模板和MPC反映的基本环节： 1变性: 高温使双链DN解离成单链.（ 30) .退火:低温下引物与模板NA互补区结合形成杂交分子.(55 3s) 3延伸:中温延伸. 在DN聚合酶、dNTP、Mg2存在下， DNA聚合酶催化以引物为起始点的DN链5向方向的延伸,合成出与模板DNA链互补的NA子链. (0-72 0-60s) 以上三个环节为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板,通过n次循环后,目的A以2形式增长.2.2. PCR检测PCR反映扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了核心。荧光素(溴化乙锭,EB)染色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电
7、泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但由于其简捷易行，成为了主流检测措施 2.12.3 PCR反映体系第一次PC扩增：调节PC反映体系中各成分、构成及反映条件，经多次反复实验成果得出下面的体系可得到清晰明亮的目的DNA电泳条带（1kb): P反映体系2100ul（每管l,共8管) yrobe 2u ffer() 10l W4（模板） 2ul P2a（10M) 4ul P2(10uM） ul dNP(2.5x） ul dd2O 76CR反映条件： 94 min 30 cles： 4 4s 5 0s 72 2min3 72 0min 4 frer 将扩增产物进
8、行琼脂糖凝胶电泳（措施见2.1.3电泳),切胶回收目的DNA条带,共切3管,分别标注A、B、C.一方面用25ul约6的无菌蒸馏水洗脱A管一次,洗脱液标注1,分别用1ul的无菌蒸馏水洗脱B管和管,得到的DA洗脱液标注2,最后各用30ul的无菌蒸馏水洗脱A、B、C管,得到的DA洗脱液分别标注a、b、c.第二次PCR扩增(带酶切位点）： 分别用DNA的洗脱液2、a、b、c为模板,进行第二次PCR扩增，设计反映体系（各25ul）如下： 模板2 模板a 模板b 模板 Pyrobest 0.5l 0.5ul 5ul 0.ul bffer（x) 2.l 2.ul .5ul 2.5ul 模板 0ul 2ul
9、ul ul Pa(10uM) 1ul 1ul ul 1l 2(10uM） u 1 ul 1ul dNTP（2.5x) 05l 0.5ul 0.5ul 0.5ul dd2O 1ul .5l 15.5ul 35ulPCR反映条件: 9 5min 3cyces: 94 0s 54 0s 72 2mi30s 2 10min 4 orevr电泳成果表白:以2管和c管为模板可得到明显的目的基因条带,根据本次电泳成果,可先后再运用P扩增(各100u,每管2,共8管) PCR反映体系20ul（每管25ul,共8管） 模板2 模板c robst 2ul 2ul bufer（0x) 10ul 10ul 模板 ul
10、 40u a（10M） ul 4ul Pb(10u） 4u 4u NTP（2.5x) ul ul dH2O ul 8ulPC反映条件: 4 5in 30 cycles: 9 40 54 40s 72 2min30s 2 mn 4 foreer电泳条带明显并且明亮,切胶回收保存待用.。2.1.3 电泳 2.3.1 配胶配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(X TAE Bufe)根据制胶量和凝胶浓度,精确称量琼脂糖粉（1）,加入合适的锥形瓶中。 加入一定量的电泳缓冲液(1X AE Bue 100）。 熔化完全,冷却至6C左右，加入EB5-7l，充足混匀。 将溶液倒入制胶模中,之前应在合适位置插上梳子。室
11、温下凝固，不立虽然用时,可用保鲜膜将凝胶包好后放40C 保存,一般可保存2-5天。2.1.3.2 电泳 取适量的PCR产物与适量的溴酚蓝混合混匀后加入凝胶槽中，另取适量的NA Mk 加入右边槽中,开始电泳。.1.3.3 紫外观测电泳条带 当溴酚蓝跑到合适位置时，在紫外光下观测目的基因的电泳条带（1b处) 21. 切胶回收目的DA切胶回收目的DA的措施环节: 操作流程见右图,全套操作约需3分钟,具体阐明如下。1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的NA进行琼脂糖凝胶电泳。2. 在紫外灯下切出具有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高N回收率。注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以避免DNA损伤。3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作环节的胶块融化时间，提高DNA的回收率。4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1m1进行计算。5. 向胶块中加入胶块融化液D-I Buffer，R- Buffer的加量如下表:
