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1、斑蝥素及斑蝥素类衍生物研究概况2008级博士 初华丽 学号:B0815701由鞘翅目芫菁科(Meloidae)昆虫体内提取的斑蝥素（cantharidin，C10H12O4）是一种重要的抗癌物质，它是一种单萜类的防御物质，其性寒味辛，有剧毒。中医认为“斑蝥的药用价值在于其外用能蚀死肌、敷疥癣、除恶疮，内服有攻毒、逐瘀散结、抗肿瘤等作用”【1】。现代药理学的研究证实：斑蝥素具有很好的抗菌、抗病毒作用，可以很好治疗皮肤上的病毒性疣、瘤等疾病。除此之外，斑蝥素有很好的抗癌活性，特别是对原发性肝癌有特效。随着人们对斑蝥素研究的逐渐深入，斑蝥素开始被广泛利用，而斑蝥素类的衍生物因为在保持了斑蝥素的抗癌活
2、性的同时毒性降低，开始作为重要的抗癌药物被人们所重视并研究。1 斑蝥素的研究概况1.1 斑蝥素的结构及化学性质1810年法国学者Robiquet【2】首次从鞘翅目芫菁科昆虫中提取了斑蝥素晶体物质。此后被Gadamen【3】经研究证明了斑蝥素（cantharidin）的化学结构及性质。斑蝥素是一种单萜类的化学物质，其结构为外型-1,2-顺二甲基-3,6-氧桥六氢化邻苯二甲酸酐，其升华温度为120，熔点215216。1.2 斑蝥素的提取当前所用斑蝥素都是来自野外采集芫菁提取而得，1980年Dauben【4】在1.52107kPa下利用Diels-Alder反应经12步合成了斑蝥素，但反应条件苛刻，
3、产率底，不宜规模化生产。通过研究，人们发现斑蝥素具有溶解于丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯等油脂，并且微溶于热水的性质，将芫菁成虫干燥后粉碎，经浓盐酸酸化、丙酮提取、浓缩、重结晶，得到药用成分斑蝥素【5】。此后，周游等【6】应用自行设计的电刺激活体提毒装置，对大斑芫菁活体成虫内的斑蝥素进行了提取研究。结果表明，利用电刺激作为主要手段进行人工提毒装置与传统的斑蝥死体提毒相比，活体提毒法能够充分利用活体芫菁成虫生活期中的再生恢复能力，获取更多的纯品斑蝥素，能够提高斑蝥资源的利用率，并且此方法具备加快提毒速度，降低成本，提高取毒安全性等优点，是一种更方便且使用的提取斑蝥素的新方法。梅清华等通过研
4、究还探讨了用超声波的方法提取斑蝥素的最佳工艺【7】，其结果表明：以0.125 molL-1氢氧化钠溶液作溶剂的情况下，600KHz超声波提取斑蝥素40 min(25+15)可获得与煎煮法相当提取率(P0.05)，验证了该超声波提取工艺的可行性。研究者普遍采用中华人民共和国药典中规定的直接浸提法及酸水解法，李晓飞等研究对斑蝥样品制备方法进行改进，并且与药典中的方法进行比较【8】，结果表明：其改进后的酸水解法处理后的斑蝥素含量要高于采用药典中规定方法处理后的斑蝥素含量的1倍多，并且节约了材料，能源和水资源，是一种简单又经济的方法。1.3 斑蝥素的活性、抗癌机制及临床功效斑蝥素作为重要的抗肿瘤中药材
5、已经投入到了临床，实验表明，斑蝥素能够缓解原发性肝癌患者病情，平均能够延长患者11个月生存率【9】。除能够有效的缓解原发性肝癌、贲门癌、食道癌、消化道肿瘤、乳腺癌、纤维瘤、肺癌等肿瘤症状外，斑蝥素还具有治疗尖锐湿疣（特别是妇女下生殖道尖锐湿疣）、风湿病、急性扁桃体炎乳腺癌、纤维瘤、何杰金氏病、等功效。随着斑蝥素越来越广泛的在临床上投入应用，对斑蝥素药物活性及其抗癌机理的研究成为当今的抗肿瘤药物研究的热门。而当前对斑蝥素药物活性的研究主要集中在国内，国外学者对其抗癌机制的研究较多。李晓飞等【10】将提取的斑蝥素作用于体外培养的人喉癌HEP-2细胞及人胃癌BGC-823细胞研究了斑蝥素对两种癌细胞
6、的药物活性，并得出结论：斑蝥素对人喉癌HEP-2细胞和人胃癌BGC-823细胞均有显著的抑制作用，且随药物浓度升高其抑制作用增强，测得其抑制中浓度分别为2.88 mol/L和54.85 mol/L，但细胞周期测定结果表明，斑蝥素未能够诱导HEP-2细胞发生凋亡。据王晓华等【11】报道，斑蝥素对人宫颈癌Hela细胞的增殖有抑制作用，24、48、72h的的IC50 值分别为3.2、2.5和1.4 gml。且流式细胞术仪结合Annexin V-FTTC/PI双染法定量检测发现，斑蝥素1.4mg/ml作用后24h的Hela细胞凋亡比例为5.3%，染色为FTTC+/PI-；72h时细胞凋亡比例增至22.
7、1%，染色为FTTC+/PI+，结果证明细胞周期出现明显的G2M期阻滞。2000年孙震晓等【12】研究并证明了斑蝥素及去甲斑蝥素能够诱导人红白血病K562细胞凋亡，且凋亡大部分发生在细胞周期的M期，也有少量发生在细胞间期。此外，高振梅等【13】试验并报道了斑蝥素对NTH/3T3细胞具有抑制作用，并呈剂量依赖关系，并预测了斑蝥素对防治纤维化有关疾病的前景。金伟等【14】采用MTT法和流式细胞技术，研究了斑蝥素对HL - 60细胞和QGY7703细胞的存活率和细胞周期分布影响，结果显示：斑蝥素对HL - 60细胞的IC50是15.34mol/L，对QGY7703细胞的IC50是18.54mol/L
8、，且斑蝥素在所用剂量下能够诱导HL - 60细胞发生凋亡。王晓华等【15】通过斑蝥素对A549细胞增殖作用的研究，得出结论斑蝥素对A549细胞的增殖有抑制作用，药物作用24、48和72h的IC50值分别为3.2、2.5、1.4 mgL - 1 。其抑制作用机制为使A549细胞周期出现明显的G2/ M 期阻滞。国内还有学者将重点放在了对斑蝥素诱导癌细胞凋亡的研究，从而探讨其抗癌机制。周季兰等【16】采用Hoechst染色、TUNNEL染色及流式细胞术检测到了斑蝥素对人胰腺癌细胞SW1990凋亡的改变，并用RT-PCR和Western blot 法检测凋亡基因p53、Bcl-2及Bax的表达，其结
9、果表明斑蝥素能够诱导SW1990细胞凋亡，其作用与p53、Bax基因和下调Bcl-2有关。何太平等【17】研究并报道，斑蝥素作用卵巢癌细胞HO-8910PM时，药物对癌细胞的IC50值为47.99mol/L，流式细胞术分析细胞在S期有明显的凋亡峰出现，并得到结论斑蝥素抗肿瘤细胞凋亡机制可能与NF-b(p65)、Caspase-3的表达下调以及FAK酪氨酸磷酸化水平下调有关。张卫东等【18】通过MAPK途径对肺癌A549细胞周期阻滞及其分子机制进行了研究，研究表明：斑蝥素能够抑制A549细胞的增殖，24 h的IC50值为3.2 mg/L，斑蝥素作用于A549细胞后引起G2/M期阻滞，p34cdc
10、2、phos-p34cdc2蛋白表达量未改变，cyclinB1、survivin蛋白表达量减少，p21蛋白表达量增加。ERK1/ERK2、phos-ERK1/phos-ERK2表达量降低。推测斑蝥素通过调节cyclinB1、p21、survivin、ERK1 /ERK2、phos-ERK1/phos-ERK2等蛋白表达或活性的改变能够特异性地引起G2 /M期阻滞。国外学者对斑蝥素抗癌机制的研究也逐渐深入，韩国学者Huh等【19】对斑蝥素作用于人U937细胞并引起细胞凋亡做了深入的研究，通过MAPK途径选取PD98059, SB202190 和SP600125用于抑制ERK-1/2, p38 和
11、JNK蛋白，结果表明PD98059未影响细胞毒性及凋亡，但SB202190 和SP600125通过引起p53，MDM-2，p21、caspase-3的下调，并通过比色测定其干扰caspase-3活性，证明斑蝥素能够通过激活p38和JNK MAP激酶信号通路引起U937细胞凋亡。2006年Huan等【20】报道了斑蝥素作用人膀胱癌细胞的研究，斑蝥素作用于人膀胱癌T 24细胞6，24，48h后，测得的IC50值分别为21.8，11.2和4.6m。且作用时间增加后，细胞毒性未增强。此外，药物作用后PARP、pro-caspase3及Bcl-2蛋白的表达被抑制，处理期间caspase 3抑制显著并引起
12、细胞死亡。然而当低剂量的斑蝥素作用T 24细胞时，细胞周期阻滞于G2/ M 期，此时p21Cip1/Waf1表达增加，cyclin A，B1和cdk1蛋白表达减少，当斑蝥素剂量加大时（12.5m），药物可刺激T 24细胞ATP减少从而引起细胞死亡，并且斑蝥素还刺激T 24细胞内COX 2的过度表达以及PGE2产生，呈药物剂量依赖关系。因此斑蝥素可通过将细胞阻滞于G2/ M 期及引起COX 2的过度表达从而诱导人膀胱癌T 24细胞凋亡。Jiang等【21】在研究斑蝥素及其他3种药物对肿瘤干细胞的药物活性中还提出，斑蝥素及姜黄素作用于肿瘤干细胞的抗癌活性与喜树碱比较则相对较低。2 斑蝥素类衍生物研
13、究概况斑蝥素虽具有重要的抗癌活性，但其对肾脏的毒性及副作用也相对较高，这也成为抗癌药物研制中难以突破的一个重要问题。 随着人们对斑蝥素的深入研究，多种斑蝥素类衍生物随即出现，这些斑蝥素的合成物由应用药理学，应用组合化学等方法进行结构改造，并更好的应用于临床治疗，其作用可能更强，毒性较斑蝥素也更小【22】。2.1 去甲斑蝥素抗癌活性及机理研究概况在系列斑蝥素类衍生物中，目前研究抗癌活性及机制较多的是去甲斑蝥素（norcantharidin, NCTD）。黄松音等【23】探讨了去甲斑蝥素抑制人乳腺癌细胞SKBR3增殖及侵袭转移的机制，并得出结论，去甲斑蝥素具有抗癌活性，可以抑制乳腺癌SKBR3细胞
14、增殖，且抑制作用亦呈剂量效应关系，采用MTT法测得IC50值为12.5 mg/L，通过流式细胞术分析，当10 mg/L去甲基斑蝥素作用于癌细胞24h，48h后，能够特异地使SKBR3细胞发生G2 /M期阻滞，且G2 /M期细胞百分比分别为35.82%、38.70%，G1期和S期细胞较对照组明显减少,亚G1和G0峰DNA含量逐渐增加，24 h、48 h的凋亡率分别为3.44%和6.17%。 试验并证实了SKBR3细胞的体外黏附、运动、侵袭转移能力随NCTD药物浓度提高而下降，可知去甲斑蝥素可抑制肿瘤细胞对基质黏附、迁移运动及侵袭转移。2000年戎熠等【24】报道了去甲斑蝥素作用人乳腺癌细胞系MC
15、F-7的抗肿瘤作用的分子机制的研究，结果表明，10 g/ml的去甲斑蝥素作用12h后，MCF-7细胞变形、出泡，从培养瓶底脱离。流式细胞术检测，药物作用24h后，G1期细胞减少，G2+M期细胞明显增多，随着药物作用时间的延长，细胞凋亡百分比逐渐增加【25】。且凋亡抑制基因bcl-2蛋白的表达明显降低，以此推论，诱导MCF-7细胞凋亡可能是去甲斑蝥素抗肿瘤作用的分子机制之一。据孙振晓等【26】报道，10mg/L去甲斑蝥素作用人肝癌BEL-7402细胞24h后，部分细胞出现了细胞固缩、细胞质膜突起、核染色质出现异常，并伴有膜包被的凋亡小体的形成。经过免疫细胞组化及 Western blot分析显示
16、该过程伴随bcl-2蛋白表达减弱，分析可得去甲斑蝥素能够诱导人肝癌BEL-7402细胞发生凋亡，且凋亡与bcl-2蛋白表达下调有关。唐龙英等【27】利用细胞培养技术，以结晶紫染法测定了去甲斑蝥素对人卵巢癌3AO和AO细胞的体外杀伤作用，并通过电镜观察了NCTD在体内对卵巢癌的作用效应。结果表明，体外实验时，NCTD对卵巢癌3AO和AO细胞均有杀伤作用，且呈浓度和时间依赖性，测得IC50值分别为20g/ml和10g/ml，PCM下观察药物作用后的细胞变圆并呈悬浮状，TEM观察药物作用后的肿瘤细胞胞浆大片脱落，线粒体水肿，细胞质呈空泡样。并利用流式细胞仪测定分析NCTD作用两种肿瘤细胞的细胞周期变化发现，肿瘤细胞G2+M期细胞百分比明显升高，而S期细胞百分比相应的明显降低，提示NCTD抗肿瘤细胞增殖的机制可能与其将肿瘤细胞阻滞于G2+M期有关【28】。而体内试验表明，无论腹腔注射还是刘内注射NCTD都有一定的抑瘤效应，且随着治疗时间的延长肿瘤增长变得缓慢。李琦等【29】通过动物实验
