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1、实验五、pcr扩增和琼脂糖电泳检测一、实验目的学习和掌握PCR扩增及琼脂糖电泳的基本原理和方法。二、实验原理多聚酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）的原理类似于DNA的天然复制过 程。其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性-退火-延伸三个基本 反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93C左右一定时间后，使模板 DNA双链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的 退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板DNA单链 的互补序列配对结合；引物的延伸:DNA模板-引物
2、结合物在TaqDNA聚合酶的作用下， 以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复 制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。因此，首先在待扩增的DNA片段两侧设计寡核苷酸引物，经变性（94C）、退火（4568C） 和延伸（72C）若干个循环后，DNA扩增2n倍。所使用的酶为耐热的DNA聚合酶（Taq酶）。琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持物，在适当条件下对带电生物大分子进行电泳的技 术。主要用于生物大分子的分离、纯化与鉴定。DNA分子在高于其等电点的PH值溶液中带 负
3、电荷，在电场中向正（阳）极移动。其迁移速度与其分子量大小成反比。电泳后，不同大 小的DNA片段呈现迁移位置的差异，把已知分子量的标准DNA即Marker,与待测DNA同时 电泳，比较两者在琼脂糖凝胶板上的区带位置，即电泳图谱，就可以鉴定出待测DNA的大小 及浓度。荧光染料EB （溴化乙锭）能嵌入DNA分子碱基对中，在紫外光下发荧光，据此可 测知DNA片段所在的位置。将DNA加到凝胶的负极，在电场的作用下，将不同大小的片段 分开。三、仪器、材料与试剂（一）仪器：微量移液器，PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统及紫外检测系统（二）材料与试剂：基因组DNA，dNTPs （2.5mmol/L）,上下游引
4、物（浓度10ymol/L）, rTaq 酶（5U/yL）, DL2000 DNA Marker，10xPCR 缓冲液，MgCl2 （25mM），灭菌双 蒸水,1.5%琼脂糖（注意：溴化乙锭，EB,致癌），电泳缓冲液（0.5%TBE，含Tris 碱、硼酸和 EDTA， PH 8.0）， .二甲苯菁和溴酚蓝）。四、实验步骤1 、PCR 扩增反应体积（20卩1）,在0.2ml Eppendorf中依次加样：10xPCR buffer2.0卩1MgCl21.6卩1dNTPs1.6卩1上游引物0.5卩1（10卩mol/L）下游引物0.5卩1（10卩mo1/L）DNA1.0卩1ddH2O12.6卩1rTa
5、q0.2卩1反应条件：94C 3min，94C 30s，58C 30s，72C 30s （循环 28 次），72C 5min 在 PCR 扩增仪上进行扩增。2、琼脂糖凝胶电泳检测配置1.5%琼脂糖凝胶，取5卩1 PCR扩增产物+1卩1上样缓冲液电泳。DNA带负电荷， 电泳时 DNA 从负极向正极泳动（即点样孔在电泳槽的负极，注意不要将胶方向放反）。待 泳动至凝胶的 1/22/3 位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。五、作业写出实验的过程并描述你所观察到的结果，绘制电泳凝胶图。 琼脂糖凝胶电泳时有哪些注意事项？影响DNA分子在琼脂糖凝胶中电泳速度的因素有哪些？UUJU1U11JXU u i um
6、uiummGTAACAAAGG AAAAGTTGCT GCATTTACAT GAGCTAGTTT GAGAACAGCTAGCTGCTGGTCACATAGTGC CTACTACCAG CCCTTGGAAT ACTCCAGTCTTTGTTATCCT CAAGAAGAGTGGAAAATGGA GGCTTTTACA GGACCTGCACACTGCCAATG CAGCAATTGA GCCCATGGGGGCATTGCAGC CTGATCTTCCTTCGCCTTCA ATGTTACCTG TGAATTGGTA CGCAGTC上游引物 5-AGTTGCTGCATTTACATGAG-3 下游引物 CAGGTAACATTGAAGGCGAAPCR反应包括三个步骤:IIDNA123变性：94-95 C,使模板 DNA的双链变性成单链复性：50-70 C,两个引 物分别与单链DNA互补复 性延伸：72 C,引物引导、Taq酶、4dNTPs，合成模板DNA的互补链
