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1、国家自然然科技资资源平台台微生物菌菌种常规规保藏技技术规程程（试行行）自然科科技资源源收集、整整理、保保存技术术规程研研究与制制定项目组二四四年十二二月十日日14目 次前言2引言31范围42定义43基本原原则54方法5附录A 定定期移植植保藏法法6附录B 液液体石蜡蜡保藏法法9附录C 沙沙土管保保藏法11参考文献献113前 言本规范由由国家自自然科技技资源平平台建设设项目提提出。本规范起起草单位位：中国国农业科科学院土土壤肥料料研究所所、中国国食品发发酵工业业研究院院、中国国兽医药药品监察察所、中中国科学学院微生生物研究究所、中中国林业业科学研研究院森森林保护护研究所所、中国国药品生生物制品品
2、检定所所、中国国医学科科学院医医药生物物技术研研究所。本规范主主要起草草人：程程池、李李金霞、胡胡海蓉、姜姜瑞波、顾顾金刚、周周宇光、朴朴春根、叶叶强、张张月琴、陈陈敏等。引 言微生物菌菌种常规规保藏是是一类重重要的基基本操作作技术，广广泛应用用于科学学研究、教教学及生生物技术术产业，是是保护微微生物菌菌种资源源的重要要手段，是是科研教教学及生生物技术术产业正正常运转转的重要要保障。本本规程包包括定期期移植保保藏法、液液体石蜡蜡保藏法法和沙土土管保藏藏法三种种常用微微生物菌菌种保藏藏方法。制定本规规程是为为了规范范微生物物菌种常常规保藏藏技术操操作，加加强管理理，以达达到保护护微生物物菌种资资
3、源，利利用微生生物菌种种资源及及实现资资源共享享的目的的。微生物菌菌种常规规保藏技技术规程程1范围本规程规规定了微微生物菌菌种常规规保藏技技术的基基本原则则和方法法。本规程适适用于微微生物菌菌种的常常规保藏藏工作。2定义本规程采采用下列列定义。2.1微生物菌菌种资源源 miicrooorgganiism ressourrcess指可培养养的有一一定科学学意义、具具有实际际或潜在在实用价价值的古古菌、细细菌、真真菌、病病毒、细细胞株等等及其相相关信息息数据。2.2菌种保藏藏 cuultuure preeserrvattionn 是指将微微生物菌菌种用各各种适宜宜的方法法妥善保保藏，避避免死亡亡、
4、污染染，保持持其原有有性状基基本稳定定。2.3定期移植植保藏法法 suubcuultuurinng 亦称传代代培养保保藏法，包包括斜面面培养、穿穿刺培养养、液体体培养等等。是指指将菌种种接种于于适宜的的培养基基中，最最适条件件下培养养，待生生长充分分后，于于46进行保存存并间隔隔一定时时间进行行移植培培养的菌菌种保藏藏方法。2.4液体石蜡蜡保藏法法 prreseervaatioon uundeer lliquuid parrafffin亦称矿物物油保藏藏法,定定期移植植保藏法法的辅助助方法。是是指将菌菌种接种种在适宜宜的斜面面培养基基上，最最适条件件下培养养至菌种种长出健健壮菌落落后注入入灭菌
5、的的液体石石蜡，使使其覆盖盖整个斜斜面，再再直立放放置于4415进行保保存的一一种菌种种保藏方方法。2.5沙土管保保藏法 saand preeserrvattionn亦称载体体保藏法法。是指指将培养养好的微微生物细细胞或孢孢子用无无菌水制制成悬浮浮液,注注入灭菌菌的沙土土管中混混合均匀匀，或直直接将成成熟孢子子刮下接接种于灭灭菌的沙沙土管中中，使微微生物细细胞或孢孢子吸附附在载体体上，将将管中水水分抽干干后熔封封管口或或置干燥燥器中于于415进行保保存的一一种菌种种保藏方方法。3基本原原则3.1 应针对对菌种特特性选择择适宜方方法进行行保藏。3.3 应保证证菌种保保藏的安安全性，不不能对周周围
6、环境境造成污污染和危危害。4方法4.1 定期移移植保藏藏法 见附录录A。4.2 液体石石蜡保藏藏法见附录BB。4.3 沙土管管保藏法法 见附录录C。附录A定期移植植保藏法法A.1 适用范围围本方法适适用于大大多数细细菌和真真菌。A.2 原理低温条件件下保藏藏可减缓缓微生物物菌种的的代谢活活动，抑抑制其繁繁殖速度度，达到到减少菌菌株突变变，延长长菌种保保藏时间间的目的的。保藏培养养基一般般含较多多有机氮氮，糖分分总量不不超过22%，既既能满足足菌种培培养时生生长繁殖殖的需要要，又可可防止因因产酸过过多而影影响菌株株的保藏藏。A.3 技术要求求A.3.1 不同菌种种应根据据要求选选择合适适的培养养
7、基。A.3.2 接种时要要求无菌菌操作，避避免染菌菌。A.3.3 保藏期间间要定期期检查菌菌种存放放的房间间、冷库库、冰箱箱等的温温度、湿湿度，各各试管的的棉塞有有无污染染现象，如如发现异异常应取取出该管管，重新新移植培培养后补补上空缺缺。A.3.4 大量菌种种同时移移植时，各各菌株的的菌号、所所用培养养基要进进行核对对，避免免发生错错误。A.3.5 每次移植植培养后后，应与与原保藏藏菌株和和菌株的的登记卡卡片逐个个对照，检检查无误误后再存存放。A.3.6 斜面菌种种应保藏藏相继三三代培养养物以便便对照，防防止因意意外和污污染造成成损失。A.4 方法与步步骤A.4.1 培养基制制备A.4.1.
8、1 器皿准备备培养基制制备过程程中所用用的一些些玻璃器器皿，如如三角瓶瓶、试管管、培养养皿、烧烧杯、吸吸管等，根根据不同同情况洗洗涤、干干燥、包包装、灭灭菌后使使用。A.4.1.2 溶解培养养基配料料先在烧杯杯中放适适量水，按按培养基基配方称称取各项项材料，依依次将缓缓冲化合合物、主主要元素素、微量量元素、维维生素等等材料加加入水中中溶解，最最后加足足水量。A.4.1.3 调pH值值配料溶解解后将培培养基冷冷却至室室温，根根据要求求加稀酸酸或稀碱碱调pHH值。加加酸或碱碱液时要要缓慢、少少量、多多次搅拌拌，防止止局部过过碱或过过酸而导导致测量量不准确确和营养养成分被被破坏。A.4.1.4 加凝
9、固剂剂配制固体体培养基基时需加加凝固剂剂，如琼琼脂、明明胶等。将将凝固剂剂加入液液体培养养基中，加加热并不不断搅拌拌至融解解，再补补足所蒸蒸发水分分。A.4.1.5 过滤分装装在二层纱纱布中间间夹入脱脱脂棉，将将配好的的培养基基趁热过过滤并分分装，斜斜面培养养基不宜宜超过试试管高度度的四分分之一。分分装过程程中勿使使培养基基沾污管管口，以以免弄湿湿棉塞造造成污染染。A.4.1.6 包扎标记记将试管加加棉塞，外外面包扎扎一层牛牛皮纸或或铝箔并并注明培培养基名名称及配配制日期期。A.4.1.7 灭菌根据要求求将培养养基灭菌菌。灭菌菌后摆放放斜面时时，斜面面长度不不超过试试管管长长的二分分之一为为宜
10、。A.4.1.8 无菌检查查将灭菌的的培养基基放入培培养箱中中作无菌菌检验。A.4.2 接种A.4.2.1 斜面接种种A.4.2.11.1 点接把菌种点点接在斜斜面中部部偏下方方处。适适用于扩扩散型生生长及绒绒毛状气气生菌丝丝类霉菌菌（如毛毛霉、根根霉等）。A.4.2.11.2 中央划划线从斜面中中部自下下而上划划一直线线。适用用于细菌菌和酵母母菌等。A.4.2.11.3 稀波状状蜿蜒划划线法从斜面底底部自下下而上划划“之”字形线线。适用用于易扩扩散的细细菌，也也适用于于部分真真菌。A.4.2.11.4 密波状状蜿蜒划划线法从斜面底底部自下下而上划划密“之”字形线线。能充充分利用用斜面获获得大
11、量量菌体细细胞，适适用于细细菌和酵酵母菌等等。A.4.2.11.5 挖块接接种法挖取菌丝丝体连同同少量琼琼脂培养养基，转转接到新新鲜斜面面上。适适用灵芝芝等担子子菌类真真菌。A.4.2.2 穿刺接种种用直接种种针从原原菌种斜斜面上挑挑取少量量菌苔，从从柱状培培养基中中心自上上而下刺刺入，直直到接近近管底（勿勿穿到管管底），然然后沿原原穿刺途途径慢慢慢抽出接接种针。适适用于细细菌和酵酵母菌等等。A.4.2.3 液体接种种挑取少量量固体斜斜面菌种种或用无无菌滴管管等吸取取原菌液液接种于于新鲜液液体培养养基中。A.4.3 培养将接种后后的培养养基放入入培养箱箱中，在在适宜的的条件下下培养至至细胞稳稳
12、定期或或得到成成熟孢子子。A.4.4 保藏A.4.4.1 保藏温度度和时间间培养好的的菌种于于46保存，根根据要求求每36个月移移植一次次。对于于某些菌菌种，如如芽裂酵酵母，阿阿舒假囊囊酵母，棉棉病囊霉霉等，须须13个月移移植一次次。A.4.4.2 保藏湿度度用相对对湿度表表示，通通常为550%70%。测量量仪表采采用毛发发湿度计计或干湿湿球湿度度计。A.4.5 移植培养养将培养物物转接到到另一新新鲜培养养基中，再再在适宜宜条件下下培养。A.4.6 菌种复壮壮菌种如有有退化，应应将退化化的菌种种引入原原来的生生活环境境中令其其生长繁繁殖，通通过纯种种分离，在在宿主体体内生长长等方法法进行复复壮
13、。附录B 液体石蜡蜡保藏法法B.1 适用范围围本方法适适用于不不能分解解液体石石蜡的酵酵母菌、某某些细菌菌(如芽芽孢杆菌菌属，醋醋酸杆菌菌属等)和某些些丝状真真菌(如如青霉属属，曲霉霉属等)。B.2 原理液体石蜡蜡保藏法法可作为为定期移移植保藏藏法的辅辅助方法法。在液液体石蜡蜡覆盖下下，菌种种的生物物代谢受受到抑制制，细胞胞老化被被推迟。此此方法可可阻止氧氧气进入入，使好好气菌不不能继续续生长，也也可防止止因培养养基的水水分蒸发发而引起起的菌体体死亡，达达到延长长菌种保保藏时间间的目的的。B.3 技术要求求B.3.1 菌种培养养参照附附录A。B.3.2 应选用优优质化学学纯液体体石蜡。B.3.3 液体石蜡蜡易燃，在在对液体体石蜡保保藏菌种种进行操操作时注注意防止止火灾。B.3.4 保藏场所所应保持持干燥，防防止棉塞塞污染。B.3.5 保藏期间间应定期期检查，如如培养基基露出液液面，应应及时补补充灭菌菌的液体体石蜡。B.4 方法与步步骤B.4.1 液体石蜡蜡将液体石石蜡分装装加棉塞塞，用牛牛皮纸包包好，00.1MMPa灭灭菌300分钟取取出，置置40恒温箱箱蒸发水水分，经经无菌检检查后备备用。B.4.2 斜面培养养物的制制备参照附录录A，斜面面宜短，不不超过试试管三分分之一为为宜。B.4.3 灌注石蜡蜡 无菌条件件下将灭灭菌的液
