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1、靛酚蓝比色法测定土壤脲酶的活性一、实验目的：1. 测定土壤脲酶活性的意义。2. 掌握测定土壤脲酶活性的原理和方法。二、实验原理靛酚蓝比色法的基本原理是：被测物浸提剂中的NH4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的NH4+-N含量呈正比，线性范围为0.050.5mg/l之间。 靛酚蓝反应原理如下:NH3 + OC1NH2 Cl +OH-+ NH.Cl + OH Fe(CN)3ONO三、实验试剂1）10%尿素：称取 10g 尿素，用蒸馏水溶至 100ml。2） 柠檬酸盐缓冲液（PH=6.7）： 184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶 液合并，
2、用1mol/LNa0H将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升。3）苯酚钠溶液（1.35mol/L）： 62.5克苯酚溶于少量无水乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫 升丙酮，用无水乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将 AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。4）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。5） 氮的标准溶液（0.1mg/ml）：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得 到1ml含有0.1mg氮的标准液。四、实验过程1. 标准曲线的测定吸取10ml氮的标准溶液定容至1
3、00ml，摇匀。从其中分别吸取0，1.00，3.00，5.00，7.00， 10.00ml移至50ml比色管中，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，充分混合。加入3ml次氯酸 钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于578nm处，以 1cm 比色皿进行比色测定，以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为横坐标，以吸光度值为纵 坐标绘制标准曲线。2. 土样中脲酶活性的测定分别称取2g过1mm筛的风干土样于3个100ml锥形瓶中，向其中加入1ml甲苯，以使土 样全部湿润为宜。放置15分钟后，加入5ml 10%尿素溶液和10ml柠檬酸缓冲液（pH=6.7）, 并摇匀。将锥形
4、瓶放入37C恒温箱中，培养24h。培养结束后，用热至38C水稀释至刻度， 充分摇荡，并将悬液用滤纸过滤到锥形瓶中。设置有土无基质对照，即考察各种溶液和土壤中氨氮存在带来的影响。相当于其他实验中 所做的空白对照。分别吸取（）ml滤液于3个50ml比色管中，加蒸馏水至20ml，充分震荡，然后加入4ml 苯酚钠，充分混合，再加入3ml次氯酸钠充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈 现靛酚的蓝色（在1h内保持稳定）。在分光光度计上用1cm比色杯，于578nm处进行比色测定。土壤脲酶活性以24小时1g 土壤中NH3N的毫克数表示。五、注意事项： 蒸馏水的要求无氨水； 试剂加入的顺序;测定时间的控制；六、思考题1. 测定土壤脲酶活性的意义是什么？2. 试验中为什么加入甲苯？3. 测定土壤脲酶活性的其他方法包括哪些？
