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1、编号： 2011届本科毕业论文（设计）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进 学 院 生 命 科 学 学 院 专 业 生 物 科 学 学 号 200740810235 姓名 孙 静 芳 指导教师 姬 云 涛 职称 副教授 完成日期 2011 年 5 月 目 录摘 要1关键词1ABSTRACT1KEYWORDS1引言11. 材料与方法21.1 实验材料21.1.1 试剂21.1.2 主要仪器、设备21.2 实验方法21.2.1 溶液的配制21.2.2 制胶31.2.3 电泳41.2.4 染色51.2.4.1 传统考马斯亮蓝染色法51.2.4.2 水浴加热法51.2.4.3 微波炉加热法51.2
2、.5 染色结果观察62. 结果与分析62.1 染色效果与操作的简便性62.2 不同染色方法凝胶成像结果72.3 染色时间73结论与讨论8参考文献8致 谢1016SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进 姓名：孙静芳 学号：200740810235 指导教师：姬云涛 （07级生物科学2班）摘 要：针对传统的SDS- PAGE染色法耗时长，脱色所用甲醇有毒，乙醇会同时把考马斯亮蓝颜色脱去，使蛋白质条带不清晰等问题，对常染法进行了改进。本文用水浴或微波加热处理，同时改变染色液和脱色液成分，用乙醇、蒸馏水代替甲醇，大大缩短了染脱时间，经过比较，认为改进后的水浴法所耗时间大大缩短，染色效果也较好。关键词
3、：SDS- PAGE；考马斯亮蓝；水浴法；染色；脱色A Modified Method for SDS-PAGE StainingName： Sun Jingfang Student Number ：200740810235 Dvisor：Ji YuntaoAbstract: For the traditional SDS-PAGE time-consuming staining, Coomassie brilliant blue colorcan be taken off by the ethanol used for bleaching, methanol is toxic,the pro
4、tein bands is not clear, and other issues,an improved method for the common dyeing is coming.By using a water bath or microwave heat treatment, at the same time changing the composition of dyeing and bleaching liquid,ethanol,distilled water instead of methanol,reducing the time of dyeing off greatly
5、.By comparision,that the bathing method improved reduces the time significantly, dyeing better.Keywords：SDS- PAGE；coomassie brilliant blue；water bathing ；staining； decolorization引 言继人类基因组计划之后，蛋白质组学已经成为21世纪生命科学研究的热点，对蛋白质高分辨率的分离和准确鉴定变得至关重要。目前分离蛋白质的主要方法之一就是采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS- Polyacrylamide Gel E
6、lectrophoresis, SDS- PAGE），它的支持介质是三维网状的聚丙烯酰胺凝胶。在催化剂的作用下，单体丙烯酰胺（acrylamide，Acr）与N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide，交联剂 ，Bis）发生聚合反应，生成凝胶介质。由于不同蛋白质分子大小和所带电荷的不同，从而对蛋白质进行分离，而分离后的电泳凝胶检测的染色方法也有多种，其中考马斯亮蓝染色法由于具有很强的特异性、较少的干扰因素、操作简便等优点，而成为蛋白质电泳检测和定量分析的一种常用方法。常用的考马斯亮蓝有G-250，R350，和R-250三种，在游离状态下，考马斯亮蓝G-250
7、为红色，其最大吸收值为488 nm；而它与蛋白质结合后颜色由红色变为青色，在595 nm 波长下二者的结合物光吸收最大，光吸收值和蛋白质的含量成正比关系，所以可用于蛋白质的定量测定1。考马斯亮蓝G-250是快染，能与蛋白质迅速进行结合反应，约2 min 即可达到平衡；它们的结合物在室温下1 h 内保持稳定。一般情况下传统考马斯亮蓝染色法染脱时间较长，约 6 24 h2 ，同时在多次漂洗、换液的过程中，凝胶表面容易被污染3，而且凝胶中的SDS会干扰考马斯亮蓝和蛋白质的结合，使染色效果受到影响。同时常染所用的甲醇易挥发，在人体代谢作用下会转化为甲酸，进而在人眼睛部位积累，对视神经细胞进行破坏，危害
8、操作者健康4。本文采用考马斯亮蓝G-250进行染色，通过水浴和微波热处理法，对传统的考马斯亮蓝染色法进行改进，以期达到大大缩短凝胶染色、脱色时间，从而使操作更简便，所用试剂更少，成本更低，更有利于操作者的健康的目的。 1. 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 试剂 浓硫酸，甘油，巯基乙醇，N,N,N,N四甲基乙二胺（TEMED），浓缩胶缓冲液（1 M的Tris-HCl pH 6.8），无水乙醇，冰乙酸，双蒸水，牛血清白蛋白（68 kb），考马斯亮蓝G-250，丙烯酰胺，N,N-甲叉双丙烯酰胺，溴酚蓝，十二烷基磺酸钠(SDS)，甘氨酸，Tris碱，过硫酸胺。1.1.2 主要仪器、设备 直流稳压
9、电源，水平脱色摇床（太仓科技器材厂），移液枪，垂直电泳槽，凝胶成像分析仪（金西盟北京仪器有限公司），pH计，量筒，烧杯，容量瓶，电子天平（奥豪斯仪器上海公司），低温冰箱(合肥美菱有限公司)，双蒸水蒸馏器，灌胶支架，电磁炉（九阳股份有限公司），水浴锅，微波炉等。1.2 实验方法1.2.1 溶液的配制51.2.1.1 30 %的丙烯酰胺 用电子天平分别称取丙烯酰胺29.2 g，N,N亚甲基双丙烯酰胺0.8 g，用60L热的双蒸水溶解，过滤，定容到100 L。（由于未聚合的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性，操作均须戴口罩手套，并在通风处进行，保存于棕色瓶中，4 存放。）1.2.1.2 10%十二
10、烷基硫酸钠（SDS） 用电子天平称取10 gSDS粉末，于90 mL双蒸水中加热至68 溶解，定容至100 mL，室温保存。1.2.1.3 10 %过硫酸胺（AP）称取0.5 g过硫酸铵于5 mL双蒸水中溶解，4保存（需新鲜配制）。1.2.1.4 分离胶缓冲液（1.5 M的Tris-HCl pH 8.8） 用电子天平称取18.16 gTris粉末，于80 mL双蒸水中溶解，pH计测量并用浓盐酸调节pH至8.8，后定容至100 mL，4 保存。1.2.1.5 Tris-甘氨酸5 X电泳缓冲液分别用电子天平称取6.0 gTris粉末和28.8 g甘氨酸，用900 mL双蒸水溶解，再加入1 gSDS
11、，用容量瓶定容至1000 mL。1.2.1.6 5 X上样缓冲液 分别量取0.6 mL 1M Tris-HCl pH6.8缓冲液，5 mL 50%的甘油，2 mL 10 %的SDS，0.5 mL巯基乙醇，1 mL 1 %溴酚蓝，0.9 mL双蒸水，混合，4保存待用。1.2.1.7 蛋白质原液的配制 称取0.1 g的牛血清白蛋白，于100 mL双蒸水中溶解，即为1000 g/mL的蛋白质原液。1.2.2 制胶61.2.2.1 确定所要配制分离胶的浓度和体积。 表1 SDS-PAGE凝胶的有效分离范围丙烯酰胺浓度（%）1512.5107.55.0蛋白质线性分离范围（ kDa）15-43515-60
12、 18-75 30-120 60-212 由于实验所用标准蛋白的分子量为68 kb，并结合其他文献综合考虑应选择浓度为10 %的分离胶。先用洗涤剂分别把玻璃板，样品梳，Space洗净，双蒸水冲洗几次，吹风机吹干。 把Space安装到制胶架上，按要求用制胶模安装并固定好玻璃板(两边均匀用力)，插入梳子后，在距齿底约1 cm的地方用记号笔做个标记，去除加样梳，以有利于目测分离胶灌制的大致位置。1.2.2.2 配制8 ml 10 %的分离胶。表2 分离胶的配制比双蒸水1 MTris-HCl pH 8.8缓冲液30 %Acr-Bis10 %SDS10 %AP10 %TEMED 3.0 mL2.1 mL
13、2.8 mL80 L56 L6 L TEMED为加速剂应最后加入，烧杯中迅速混合均匀后，向玻璃板间一次性缓缓灌制分离胶到标记处，并立即沿玻璃壁来回移动注入一层双蒸水，水封，以排空气7。约20 min后在分离胶和水层间出现一清晰界面，即表明胶已聚合5。1.2.2.3 待分离胶聚合完全后，倒去上层双蒸水，并用滤纸吸干。再配制3.0 mL 6%的浓缩胶。表3 浓缩胶的配制比双蒸水1 MTris-HCl pH 6.8缓冲液30 %Acr-Bis10 %SDS10 %AP10 %TEMED2.0 mL400 L600 L36 L24 L4 L加入AP和TEMED后，迅速混合，将浓缩胶灌制到分离胶上，接近
14、矮板顶端，立即平行插入样品梳，避免气泡，放置30 min-1 h，待胶充分聚合并老化。1.2.3 电泳1.2.3.1 装好模板（矮板于内侧），把胶条去掉并装入电泳槽中，拔出加样梳，用电泳缓冲液冲洗加样孔。将Tris-甘氨酸电泳缓冲液用双蒸水稀释5倍，加到电泳槽中，胶膜内侧液面不可超过高板，但要没过矮板。1.2.3.2 加样 （1）分别取不同浓度梯度（0.001，0.002，0.004，0.006，0.008，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/L）的蛋白质样品原液20 L与5 L 5 X样品缓冲液于离心管中混合，标记，用电磁炉沸水浴加热处理5-10 min，用移液枪进行点样，每个点样孔的上样量为5 L。（2）取相同浓度蛋白质样品原液20 L与5 L5X样品缓冲液于离心管中混合，加热处理5-10 min，进行点样，每个点样孔的上样量为5 L。1.2.3.3 电泳 连接直流稳压电源，打开电源开关，设定浓缩胶电压为75 V，时间50 min，待溴酚蓝进入分离胶后电压改为150 V，时间1 h。1.2.3.4 电泳结束后，关闭电源，取出凝胶模，用铲子小心撬开玻璃板一侧，凝胶便贴在其中一块板上，去除浓缩胶，并切去分离
