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1、流式细胞仪一、结构技术特点（4 个方面）：（1）流动室和液流系统（2）激光源和光路系统（3）光电管和信号测量及计算机分析系统（4）细胞分选系统流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在 液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的 参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能 测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或 蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。流式细胞计的基本结构二、原理：:荧光检测器喷嘴FACS电子控制台音图样品管激光束/正电荷偏
2、转板-负电荷偏转板分光镜集光器前向角散射光检测器液滴充电信号1、将待测细胞染色后制成单细胞悬液。2、用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出 鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一 个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。3、流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上 被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。4、这两种信号同时被前向光电二极管和 90方向的光电倍增管接收。5、光散射信号在前向小角度进行检测，光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；6、荧光
3、信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离， 形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或 其核内物质的浓度，7、经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为 可被计算机识别的数字信号。8、计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上， 液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。9、检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形 式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512 或 1
4、024 通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独 显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。10、细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的 。在流动室的喷口上配有一个 超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液 滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电 场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现 细胞的分离。三、主要应用目前，广泛应用于个体发育、胞移植实验室，用于决定PBSC采集的时机及评价外周血 采集液的收
5、益。其基本原理为荧光免疫分析，即根据外周血与骨髓中HPC表达同样的CD34 抗原(CD34+),并利用荧光标记CD34抗体与HPC膜表面CD34抗原结合，在特定波长的激光 照射下，检测CD34+胞发出的荧光强度并结合其光学特性，即较低的侧向散射(SSC)和较 高的前向散射(FSC),从而检测CD34+细胞。CD34+细胞实际上包括所有的HPC，如CFU-GM, 红细胞暴发形成单位(BFU-E),巨核细胞形成单位(CFU-Mk),混合细胞集落形成单位(CFU-Mix) 和原始细胞集落形成单位(CFU-Blast)。后两种HPC明显具有许多干细胞的特征，如它们可 以自我更新，也可定向分化为一定数目
6、的造血细胞系。体内试验也发现，经过致死剂量照射 的狒狒移植足够数量的自体CD34+细胞，可以完全恢复其造血功能，同样的现象也可在经过 骨髓、摧毁性治疗的病人中出现。有人认为，CD34+细胞在功能上可根据是否表达CD33抗 原而分为2个细胞群。早期的HPC，如CFU-Blast和LTC-IC仅表达Q CD34抗原(CD34+/CD33-), 而较为成熟的定向祖细胞可同时表达CD34和CD33抗原(CD34+/CD33+)。还有人根据CD38 抗原表达与否，将CD34+细胞分为CD34+/CD38-和 CD34+/CD38+两个亚型，并且认为LTC-IC 主要分布于CD34+/CD38-亚型，而更
7、为原始的ELTC-IC则仅分布于CD34+/CD28-细胞群，说明 CD34+/CD38-亚型性质上更接近PBSC。回顾性资料表面，移植经历了与移植物中不同分化程度的HPC有关的两个阶段。起初， 与早期造血恢复有关的是移植物中定向祖细胞(committed progenitor cell)；继之，持续性 的移植相由多能造血干细胞产生。因此，周血中不同分化程度的HPC,对指导干细胞采集及 移植成功尤为必要。目前多参数及双参数流式细胞低度均可通过CD34、CD33和CD38抗体 等检测标本中不同CD34+细胞亚型，来决定采血的时机和预测移植效果。Barnett等报道， 采集液CD34+细胞数量与外
8、周血中CD34+细胞百分率显著相关(r=0.71),并且认为准确计数 循环中CD34+细胞，可更好地预测采集液中造血干/祖细胞含量。Weaver等观察692例患 者外周血祖细胞(PBPC)采集液中CD34+细胞、单个核细胞、集落形成单位的数量与移植动 力学关系，认为PBPC采集液中CD34+细胞含量是预移植后中性粒细胞和血小板数量回升最 有力的指标。四、发展的关键流式细胞仪从细胞技术开始发展到今天，60 年代至70年代是其飞速发展时期，激光技 术、喷射技术以及计算机的应用使流式细胞仪在原理和结构上形成了固定的模式。80 年代则是流式细胞仪的商品化时期，这期间不断有新型号的仪器推出，在多参数检
9、测技术上不断提高。进入 90 年代，随着微电子技术特别是计算机技术的发展，计算能力不断提高，流式细 胞仪的功能也越来越强大。在数据管理、数据分析方面有了长足进步。但是，在技术原理和 设计方面并没有突破性的进展。人们的注意力开始转向流式细胞仪的应用，新的荧光探针、 新的荧光染料、新的染色方法不断推出，使流式细胞技术在新的细胞参数分析方面日益发展。从新推出的仪器看，流式细胞仪会在硬件上不断更新，采用更新的器件（如半导体激光、 大规模集成电路），以实现小型化；用数字电路取代模拟电路，充分发挥微处理器的功能以 实现简单化；在软件上提高数据自动分析能力，充分发挥图形界面的优点，使操作更加简便。五、更详细
10、介绍（1）组成1、流动室和液流系统 流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用 下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证 液流是稳液，一般限制液流速度u10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴 线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。2、激光源和光学系统 经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源 有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。 光
11、源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部 分集中于300400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿 光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见 光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用 染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应 需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料 激光器，则可得到550650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占
12、到一 半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相 近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定：d=4入f/nD。入为激光波长； f 为透镜焦距； D 为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐 到所需要的波长入。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路 中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例 如使用525nm带通滤片只允许FITC （Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm 绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波
13、长以上的光线通过而将此波长以下的另一 特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向 色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。3、光电管和检测系统 经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而 进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响 应特性好，在200900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10 可连续调节 ，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压 要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在
14、几个毫安。 此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不 同的PMT,因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定 性比PMT好。从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一 般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放 大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另 一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数 放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相 差1
15、2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还 有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。4、计算机和分析系统经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的， 也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道 分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘 和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的68个参 数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。 除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气
16、体等附加装置。流式细胞计的工作原理（2）参数处理 下面分别简要介绍流式细胞计有关的参数测量、样品分选及数据处理等工作原理。参数测量原理1、流式细胞计可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信 号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。 液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2n的整个空间散射光线， 散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜 和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有 关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不 经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射 光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参
