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1、本 科 生 毕 业 论 文（设计）文 献 综 述题目 Shewanella oneidensis巨大质粒的去除和功能研究 审稿人 高海春 职称 教授 质粒（英语：Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒；辞源:plasm为生殖质，-id表示粒)。大部分的质粒虽然都是环状构形，然而目前也发现有少数的质粒属于线性构形，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质
2、粒的套数(copy number)在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子，常负责编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、
3、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。在基因工程中质粒常被用做基因的载体，在宿主细胞体内外都可复制。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control) 和松弛控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有 许多拷贝,一般20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞
4、分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松弛型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时, 它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些
5、抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。质粒是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。比如根瘤菌中的pNGR234a就携带有很多对固氮作用特异性决定因子，而它的姐妹复制子pNGR234b则包含一些基因与抵抗力及解读性相关，例如编码CopC铜耐蛋白及热击蛋白的基因。Shewanella oneidensis是一种在自然界中广泛存在的-变形菌门的兼性厌氧菌，它能利用自然界中多种多样的有机化合物及金属来获得生长生存所需要的能量。Shewanel
6、la oneidensisMR-1是其中比较典型的菌株，作为一种兼性的可减少Fe和Mn的微生物，Shewanella oneidensisMR-1一直作为研究微生物诱导铁或锰氧化物矿物的溶解以及生物地球化学周期的模式生物。Megaplasmid是Shewanella oneidensisMR-1中唯一的大片段质粒，全长约0.16Mb，带有184个基因。这些基因的表达对Shewanella oneidensis的染色体基因具有一定的调控性，进而影响到Shewanella oneidensis的性状。传统敲除质粒最常用的方法是用溴化乙锭(EtBr)固化，常和热击处理结合使用，这个方法本身是很简单，
7、但据报道，在某些情况下是无效的。替代质粒固化的方法，例如使用转座子Tn5-sacB或者Tn5-rps介导的直接选择技术，也有相关文献的报道。这些系统的基本原则是通过在质粒存在的细菌中插入来引进自杀性质基因如蔗糖或链霉素敏感性基因。然而，这些自杀性/直接选择性禁言的改造，维护和适当的表达都涉及许多降低质粒固化有效性的困难。利用不相容性消除质粒提供一种广泛的质粒消除技术，这种方法基于这样一样实施：引进的第二个复制子由于(i)和原生质粒共享一个或多个质粒复制或分区系统相关的元素(ii)干扰原生质粒纠正拷贝数波动的能力能够降低原生质粒的遗传性(Novick,1987)。尽管质粒相斥技术被广泛的应用这种
8、方法的一个弊端是质粒的复制控制区或者分区区域在固化前必须被鉴定和分离。近年来，发展出一种基于转座子的质粒消除方法，首先构建一个转座子系统，通过转座作用将这个片段转座到要消除的质粒上，再引入一个可以产生消化转座子酶的质粒，通过消化转座到目标质粒上的转座子达到消除质粒的目的。消除系统的第一个组成部分是以Tn-10转座子为基础(以两个IS10末端为边界)，带有一个KmR标记基因和IS30结合位点。转座子组装在APR抗性的，不可自我复制的接合质粒pJKI336中。这个质粒被保存在DAP缺陷型的WM-3064中。将pJKI336与包含目标质粒的菌接合，在结合转移pJKI336进入菌后，根据KmR抗性筛选
9、有转座子片段插入的，当且仅当转座单元进入菌染色体或者目标质粒中菌体才能生长。插入的概率在1*10-5 和3*10-5之间。用PCR鉴定目标质粒中是否有插入。将包含转座子插入质粒的菌体与能表达IS30转座酶的质粒pJKI132接合。IS30转座酶能够通过识别高反应活性位点IS30末端转座子导致目标复制子的缺失或者整个消失。在诱导入IS30转座酶之后检测KmS型(代表复制子的缺失或者完全消失)。那些KmS型质粒DNA通过两种不同的方法进行提纯(Birnboim and Doly, 1979;Kado and Liu, 1981)。后者对大质粒的缺失更为敏感(5-200 kb)，小质粒(0.5-20
10、 kb)则用前者检测。经过检测发现，这些KmS型质粒中，有些完全消除了质粒，有些还带有小片段的质粒衍生物，需要进行进一步的筛选。基于转座子的消除方法在移除产生肠毒素的大肠杆菌（ETEC O147）及肠炎沙门菌中的大毒性质粒时虽然概率有显著性差别(前者大大高于后者)，但是同样获得了成功,而超过50%的菌消除质粒的方法跟肠炎沙门菌相似，因此这种方法可以被广泛使用。这种方法中核心的部分在于IS30结合位点。IS30最初在大肠杆菌K12中被发现，是可动遗传因子，具有可动遗传因子的两个典型特点：(1)末端有小片段的反向重复序列；(2)整合时重复目标片段。大肠杆菌中的可动遗传因子共有7个，分别为IS1到I
11、S5，以及IS30。IS30共1.2kb，带有BglII, ClaI, HindlII,NciI以及HincII等限制性酶切位点，IS30末端的反向重复序列为26bp，且有3个位点不匹配，其反向重复序列与大肠杆菌中其余6种可动遗传因子没有同源性。在转座过程中，IS30会介导复制目标质粒，产生2bp的复制片段，且在插入同源性质粒时，插入位点较为固定，可以认为是定向而不是随机插入。经研究发现，IS30可以介导DNA片段的消除以及质粒的共整合。在这篇综述中，我们主要介绍了研究对象Shewanella oneidensisMR-1以及其大片段质粒megaplasmid的相关情况，近年来人们对于质粒DN
12、A功能的逐步重视以及现阶段常用的质粒功能研究的手段。由于MR-1中的大质粒megaplasmid含有大量基因，我们有理由相信这些基因有一定的功能性，它们的表达可能对Shewanella oneidensis的染色体基因具有一定的调控性，进而影响到Shewanella oneidensis的性状。因此，将megaplasmid从Shewanella oneidensis中敲除，再逐步回补，对我们对Shewanella oneidensis的整体性研究具有非常重大的意义。参考文献1.Crossman, L.C., 2005. Plasmid replicons of Rhizobium. Bioc
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