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1、实验报告专业：姓名：学号：日期：地点：课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师:二、实验内容和原理（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 六、实验数据记录和处理八、讨论、心得同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）三、实验材料与试剂（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）七、实验结果与分析（必填）实验一 蔗糖酶的提取一、实验目的和要求:学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。、实验内容和原理：1、酵母细胞破碎细胞破雷常用方注本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母 细胞中提取出来。2、蔗糖酶的初步分离纯化蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机
2、溶剂沉淀等。本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步 的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在 提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。三、实验材料与试剂:1实验材料市售干酵母粉10g组2、实验试剂石英砂， 95% 乙醇（-20C）, 20mmol/L Tris-HCI pH7.3 缓冲液。四、实验器材与仪器：1电子天平（称量样品）；2、研砵（每组一套）；3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；4、托盘天平（离心管平衡用）；5、高速冷冻离心机；6、恒温水浴箱
3、（50C）；7、制冰机；8、 1.5ml离心管（留样品I、U用）及离心管架；9、7ml离心管（留样品川用）及离心管架 ；10、 20C 冰箱。五、操作方法和实验步骤：1、酵母细胞破碎（干磨法）称取市售干酵母粉10g,约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约 15分钟），量取总体积 50ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分 2次加在研砵内研 磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到 2支50ml离心管中，两支离心管平衡后， 4C、12000r/min离心15分钟，收集上清液并量出体积 V1 （样品I），另留1ml上清液（样 品I ）放置20C冰箱保存，用
4、于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析。2、热处理：将上一步抽提液（样品I），迅速放入50C恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒 温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50mI离心管中，平衡后，4C, 15000r/min离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积 V2 （样品U）,另留1ml上清液 （样品U）放置20C冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE 分析。3、有机溶剂（乙醇）沉淀：将热处理后的上清液加入相同体积的一 20C的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少 放置30分钟，然后转移至两支 50ml离心管中，两支离心管平衡
5、后，4C, 12000r/min离 心10分钟，弃去上清液，沉淀放置20C冰箱保存，以备用于下周实验一一实验二 离 子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。六、实验数据记录和处理：七、实验结果与分析:八、讨论、心得：1本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了细胞破碎技术、离 心技术。2细胞破碎的各种方法中，固体剪切法（研磨法）简单易行，而且干磨法比湿磨法所 得到的蔗糖酶的产率要更高一些，故选用干磨法。3本实验在对蔗糖酶进行初步纯化时的两次蛋白质沉淀的原理是不一样的，第一次是 蛋白质在高温条件下变性失活，第二次是在有机溶剂中沉淀，蛋白质保持原有构型和活性。 因为蔗糖酶比较耐高温，可以在 50摄氏度保持活性，因此蔗糖酶在纯化过程中不会有太 大的损失。但是在离心等过程中，为了尽可能地保持蔗糖酶的活性， 还是要在低温中进行4在进行离心操作前，要先对两支离心管进行平衡（要盖上离心管的盖子，因为不同 的盖子的质量也是不一样的），避免离心过程中产生较大噪音甚至损坏离心机。
