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1、第七节细胞培养污染的检验与去除一、细菌与霉菌的污染由于环境条件差和操作不当等原因，常可发生细菌和霉菌的污染。常见污染的细菌有革兰阴性菌如：大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等；革兰阳性菌有葡萄球菌等，真菌污染常可发生，尤其炎热、潮湿的季节十分常见，如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长，或产生有意物质杀死细胞。镜下可见脑浆内出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从瓶壁脱落。霉菌污染容易发现，大多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，肉眼可见，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。细菌污染如果较严重时培养基上清混浊，较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，
2、同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养，加以确定。抗生素及抗霉菌制剂对预防或排除细菌、霉苗污染均有效。工作中要特别注意和防止所用培养液和血清的污染，日前应仔细检查有无混浊和菌丝存在，以防止在培养细胞时造成污染。二、支原体污染的检测与去除（一）支原体的检测1.PCR法原理该法是通过PCR技术将支原体16srRNA基因特异性扩增，来检测培养细胞中污染的支原体。PCR引物选自16srRNA基因上的支原体特异片段，此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，经溴乙啶（EB）染色后在紫外透射仪上进行检测。16srDNA引物用水稀释至40umol/L。（1）.正向弓I物：5-ACTC
3、CTACGGGAGGCAGCAGTA-3（2）.反向引物：5-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3质粒pBR322引物用水稀释至40umol/L.（1）.正向引物：5-CATCTCGGGCAGCGTTGGGT-3（2）.反向引物：5-AGCGCAAGCGGAGTCAGTGAGC-3裂解缓冲液：10mmol/LTris-HCL（pH8.3）,50mmol/LKCL,2.5mmol/LMgcl2,5g/LTween20和5g/LTritonX-100。蛋白酶K（proteinaseK）贮存液：蛋白酶K20mg/ml口溶于50%甘油中，于-200C贮存。耐热DNA聚合酶（如Ta
4、q聚合酶）与相应的10X口TAE缓冲液（见附录A1）琼脂糖（分子生物学级）；溴乙啶（10mg/ml溶于水中并避光保存）。口6X加样染液（40%甘油、0.125%溴酚蓝和125mmol/L口EDTA）.DNA分子量标志（50ng/ml）、pBR322口DNA。DNA扩增仪、台式离心机、微波炉、电泳装置、紫外透射仪（UV）、加样枪、PCR管（0.5ml或0.2ml）。方法与步骤1）样品制备（1）将106细胞悬液或贴壁细胞刮下来的悬液放1.5ml微离心管内，以最大转速离心15min。（2）弃去上清，将细胞再悬浮于100ul裂解液中，然后加蛋白酶K，使终浓度为60ug/ml。（3）置微波炉内600C孵
5、育1h，然后升至950C10min,再将样品置室温中降温。2）PCR扩增（1）在冰浴中对各样品制备PCR重要混合物，对每个样品均加入：10XPCR缓冲液5.0ml25mmol/LdNTPs混合物0.4ul40umol/L16srDNA引物每种引物1.0ul40umol/LpBR322DNA引物每种2.0ulpBR322DNA1pg/ml2.0ulDNA聚合酶(5U/ml)0.2ul三蒸水35.4ul总量45ul(2)用无菌去离子水稀释样品为1:10，1:100。(3) 于每个eppendorf管中加45ulPCR扩增混合物，每管中分别加入样品原液及1:10,1:100稀释液各5ul，操作均在冰
6、浴中进行。(4) 在每个eppendorf管中轻轻加入50ul无菌矿物油，覆盖在液面上。如DNA扩增仪带有有制式热盖，此步骤可省略。(5) 将各管放入DNA扩增仪的孔槽内，并执行以下循环指令： 950C10min一个循环 950C,30S一580C1min一720C1min,共30个循环。 最后720C10min延长循环。3)PCR产物分析(1) 制备含有EB染料(0.1ug/ml)的1%琼脂糖凝胶(用TAE缓冲液制备)(2) 从PCR扩增仪中取出样品管，取10UIPCR扩增产物加到2ul带有染液的加样液中，混匀后加样到琼脂糖凝胶加样孔中，同时在对照孔中加10ul标准DNA分子量标志。(3)
7、凝胶置TAE缓冲液中，电压80V,电泳60-90min。(4) 凝胶电泳完毕，将凝胶置紫外透射仪下观察，有无被EB染料着色的红色荧光DNA条带,样品孔与标准DNA孔进行比较并拍照。质控与提示1) 阳性对照(1) 如果支原体DNA可查到，则10ngDNA即呈阳性结果。(2) 如得到已知支原体感染的细胞培养，细胞可同样品一样处理，作为阳性对照，处理的细胞置-200C冻存，可重复使用。2) 阴性对照(1) 用45ulPCR扩增液加5ul无菌去离子水混匀，作为阴性对照。(2) 在含45ulPCR扩增液的eppendorf管中建立一个对照孔，以2ul无菌去离子水替代pBR322DNA(1pg/ml)。(
8、3) 有时样品中可能含有聚合酶的抑制物，可阻抑PCR扩增，这种情况很易被pBR322扩增片段的缺失所识别。遇此情况是，应从同一培养物中另取少量细胞(105个)重新制备一份样品，如果这样做仍无扩增片段出现，就将细胞在无抗生素的培养基中试生长2-3周，然后再作支原体检测。因为抗生素能结合双链DNA，故有人怀疑抗生素具有抑制Taq聚合酶的活性。2.DNA荧光染色法原理DNA荧光染色法是以Hoechst或4-6-二氨基-2苯基吲哚(4-6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)试剂为荧光染料，使支原体DNA着色，用荧光显微镜在感染的靶细胞的胞质中辩认出荧光，证明试验样品中存有支原
9、体。试剂与仪器 靶细胞CKI-1(IFO5003,JCRB0008)或Vero细胞(ATCCCCL82)试验样品约106个细胞的培养上清液1ml 支原体mycoplasmahyorhinis(ATCC29052)M.orale(IFO14477)培养液MEM+10%FBS(无抗生素)无钙镁PBS固定液；甲醇：醋酸为3：1荧光染液浓缩染液（100mlPBS中加HoechstDye5mg防腐剂thimerosal10mg用磁力搅拌器助溶30min,每瓶分装1ml,严格避光保存于一20C冰箱内）使用液：将冻存的浓缩液取0.15ml加入100mlPBS中，（最终浓度为0.075g/ml的Hoechst
10、Dye0.15pg/ml的thomerosal防腐剂）用磁力搅拌器搅拌助溶30min,使色素完全溶解。（使用前调制）荧光显微镜、各种吸管、60mm玻璃平皿、10ml离心管、4个带有可活动玻片的培养皿、盖玻片（无荧光）方法与步骤（1）检验材料的制备 检体细胞的培养：被检细胞在不含有抗生素的培养中传代培养3次以上（不低于3次）在最后一次传代培养增殖期中换新鲜培养液,经2一3天培养。 细胞回收：培养细胞上清液,以及用橡胶刮匙从培养皿上刮上的细胞,吸入离心管内,于4C下，1200r/min,离心10min。吸弃上清，留下约含106个及大约1ml上清液。 冻融：将离心细胞收集到冻存管内置一20C冻结，3
11、0min后置37C孵箱内融解，如此反复操作2次，于4C1200r/min离心10min,吸取上清液作为检体。（2）标记靶细胞培养与检体的接种 将液氮（一196C）冻存的CKI1或Vero细胞解冻（37C1分钟内迅速解冻）计数活细胞达23X103/ml，植入4个带有可活动的切片在皿底的培养皿中，每培养皿1ml，置CO2孵箱内培养。 孵育24h后在显微镜下见细胞呈适当的密度（高倍镜下见160240个细胞/视野）时，弃去培养液，于每个带可活动切片平皿内换新鲜培养液0.9ml，在i号皿内接种冻融检体0.1ml在ii号皿内加0.1ml培养液，作为阴性对照，iii与iv号皿内加入100cfu/0.1ml的
12、M.hyorhinis和M.orale支原体液，作为阳性对照。将4个培养皿置CO2孵箱内培养6天。（3）细胞固定、染色、封片观察 吸弃培养液，用CMFPBS洗涤细胞加在可活动玻片上1ml固定液，固定10min。 吸弃固定液，风干后各加染色液ml置室温染色30min。 吸弃染色液,用蒸馏水洗3次，取下可玻片的杠架和垫圈，取下可活动玻片。 滴入封片液，其上复上盖玻片并赶除气泡和多余的封片液，四周用封片胶封闭。 启动紫外系统，用荧光显微镜观察（放大约X400600适宜）（4）结果判定 在细胞质中观察有无荧光，试验样品与阳性、阴性对照对应观察。 计数1000个细胞，有5个以上的细胞质中见荧光着色，可判
13、定为阳性。质控与提示（1）标记的靶细胞除CKI1和vero细胞外，3T6细胞（ARCCCCL96）也可使用。本法成功的要点之一是用作靶细胞质控的管理应严格，必预先确认该细胞无支原体的污染才能冻存使用。（2）要明确本检体的结果判定，必须使用不含抗生素的培养液。（3）染色液：Hoechst染液不稳定，故每次检测前须新鲜配制，使用DAPI也可以，均应新鲜配制。（4）试验检体：被试细胞回收时用橡胶刮匙刮下,不能用胰蛋白酶等水解酶类消化，制备好的检体细胞保存在一80C冰箱中可存放数月。（5）阳性对照：本试验采用支原体M.hyorhinis和M.orale为阳性对照，要十分注意避免有新的污染源。（6）特异
14、性与敏感性：本法不是支原体的特异性检出法，对DNA进行染色观察，对其他微生物（细胞内寄生的霉菌、细菌等）的污染，也可看出同样的荧光染色，甚至检体会含有细胞的DNA颗粒，都是引起结果判定混乱的原因。但细胞培养所污染的支原体，M.hyorhinis、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.fermentans等约占支原体污染的97，本法针对这些支原体污染的检出敏感度为1cfu,而一般污染细胞中的支原体浓度为103108cfu/ml，故本法仍具有很好的实用性。（二）支原体的去除由于支原体对细胞培养的交叉污染严重并在无意识之中发生，故对支原体检测为阳性的细胞株应丢弃；只对某些
15、贵重的细胞株而言，才设法去除支原体。常用方法有药物法、免疫法、稀释法、加热法等。从感染的细胞系中去除支原体较简单的方法是用阻碍支原体DNA或RNA合成的抗支原体类抗生素处理细胞。普遍的抗生素在细胞培养液中对支原体是无效的。而用于去除支原体的药物均为喹诺酮类和/或四环素类抗生素的衍生物。试剂与仪器抗支原体药物：四环素与截短侧耳素的复合物（BM-cyclin）；卡那霉素、二甲胺四环素与胼胝素协同使用，氟代喹诺酮类抗生素等，已有成品供应。细胞培养基：25cm2组织培养瓶口金属通风橱、CO2孵箱、离心机等方法与步骤1. 药物法细胞的去除支原体处理（1）支原体污染的细胞以105个细胞/ml（25cm2培养瓶中约10ml）接种于常规培养基并加有抗支原体药物，药物浓度为理论（想）值IC50。，即采用510倍于常用量的冲击法。（2）培养48h后，去除培养液，恢复原先处理，并在1周内重复同样的处理。（3）培养1周后，将细胞接种于常规培养基内。（4）常规培养2周后，用前法所述检测细胞有无支原体污染，如果无支原体检出，则重复实验。2至3周后再次检测以确定该结果，经这样处理的细胞认为是无支原体污染的。2. 免疫法要用抗支原体抗体或人及动物血清中的补体与污染细胞株于体外培养。支原体结合并裂解破坏支原体。或用动物接种法将污
