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1、猪气道上皮细胞的快速分离培养2005年lO月第34卷第lO期ChinJPathol,October2005,Vol34,No.10确病变的性质,并有可能为冷冻切片诊断提供一些重要线索.本文18例细胞印片误诊标本中,有10例假阳性结果,其中9例为把良性细胞诊断为异型细胞,基本不影响手术方式,有1例明显过诊断,即异型细胞诊断为恶性细胞,但冷冻切片诊断为不典型导管增生,所以未造成过治疗;8例细胞印片假阴性标本经与冷冻切片诊断结果相结合分析后仅有3例漏诊,其中2例需再次扩大手术范围.因此,细胞印片和冷冻切片检查相结合有助于进一步提高术中病理诊断的准确率.我们在报告细胞学结果采用定性诊断方式,分为良性细
2、胞,异型细胞和恶性肿瘤细胞,这种报告方式虽然简单,但可以很大程度上满足临床医生在手术中的需要.但细胞印片亦有其局限性.如果标本太少或病灶太小则不能得到足够数量有价值的细胞,常不能做出诊断.还有,细胞印片只能根据细胞的分化程度来判断其瘤细胞的性质,不能确定肿瘤有无浸润.影响细胞印片诊断的准确性主要有以下几点因素:(1)检材标本中病灶体积要足够大,没有足够数量的细胞无法做出正确诊断.(2)为防止微小病灶被遗漏,应对大猪气道上皮细胞的快速分离培养陈文书郝天玲王曦田丹吴人亮原代培养的细胞在生理上接近体内的状态,在细胞生物学研究中具有重要价值.气道(气管和支气管)上皮细胞较难培养,对生长条件要求高,目前
3、国内这方面的报道很少.我们通过多年实践摸索,已能稳定地培养猪气道上皮细胞,现介绍其具体方法及细胞微管的检测和绿色荧光蛋白(GFP)的表达.一,材料与方法1.主要试剂:转铁蛋白,DMEM/F12(1:1),胎牛血清,OptiMEM无血清培养液和Lipofectamine2000购自Gibco公司;蛋白酶X,胰岛素,表皮生长因子,氢化可的松,维甲酸,牛血清白蛋白和Hoechst33258购自Sigma公司;Ot一管蛋白(tubulin)单克隆抗体购自NeoMarker公司;FITC标记二抗购自Vector公司;即用型全角蛋白(pankeratin,PCK)抗体和sP免疫组织化学检测试剂盒购自北京中
4、杉金桥生物技术有限公司;增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFPC1)为Clontech公司产品.2.猪气道(气管和支气管)上皮细胞的分离培养和传代:根据文献建立的方法0加以改进.取新鲜宰杀的健康成年猪气管肺组织.猪气管在离左右支气管分叉前数厘米基金项目:国家自然科学基金资助项目(30200115)作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院病理学系,卫生部呼吸系疾病重点实验室?685?体标本多做剖面观察,选择典型病变区域或肿瘤细胞丰富的区域做印片,以保证足够数量有诊断价值的细胞.(3)熟练的制片技术是保障正确诊断的前提,如果制片质量不理想,会引起细胞肿胀变形,易出现假阳性结果.(4)需要有丰
5、富的细胞学诊断经验,诊断医生要对正常组织,炎症性病变及肿瘤的细胞形态熟练掌握并能分析各种干扰因素.(5)应具有扎实的外科病理诊断基础,掌握各器官系统常见疾病的鉴别诊断,可能会减少误诊.参考文献1TavassoliFA,DevileeP.WHOclassificationoftumours,Pathology&genetics.tumoursofthebreastandfemalegenitalorgans.Lyon:IARCPress,2003.10.2LeeA,KrishnamurthyS.SahinA,eta1.Intraoperativetouchimprintsentinell
6、ymphnodesinbreastcarcinomapatients.Cancer,2002,96:225-231.3王镇美,梁小曼.印片代替冷冻切片472例病理定性诊断分析.临床与实验病理学杂志,2000,16:259-260.(收稿日期:2004-12-20)(本文编辑:霍临明)有一较小的左侧分支通向左上肺,无菌条件下用血管钳在此分支下夹闭气管端及左侧支气管根部,剪除小分支及以上的气管和左侧支气管.纵向分离右叶支气管主支约8am,以粗线结扎所有小分支根部并去除分支.然后在超净台内,松开气管端,用含青霉素(500u/m1),链霉素(500m1)和二性霉素B(5g/m1)的DHanks液灌洗支
7、气管腔直至洗出液清亮为止,其间间断浸泡3次,每次约5min.总冲洗时间不少于30min.最后往腔内加满(约8m1)37预温的0.1%蛋白酶V溶液(溶于含100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的DHanks液),夹闭气管口后放入500ml的烧瓶,用含抗生素的D?Hanks液浸没组织,再置于37恒温摇床中约100r/min振摇消化4060min.然后吸出消化液,用含10%小牛血清的DMEM/F12(含100U/ml青霉素,100ml链霉素和5ml二性霉素B)洗液反复冲洗管腔,收集洗液,与消化液合并,1000r/min离心10min.离心前先取支气管内液体少许涂片在镜下检查细胞状况.离心后弃上清
8、液,沉淀用新鲜洗液重悬,再次离心5min.弃上清液,用完全培养液重悬沉淀,并反复吹打(50100次),减少细胞团,然后以约10个/am密度接种于涂有鼠尾胶原的25am塑料培养瓶,置37,5%CO:中培养.完全培养液为DMEM/F12,加胰岛素(5g/m1),转铁蛋白(10g/m1),氢化可的松(0.5g/rn1),表皮生长因子(10ng/m1),维甲酸(10mol/L),牛血清白蛋白(0.5mg/n)和5%胎牛血清,醢_埋生皇盘,l正l.出盥Chi.Jjlmh_L苎zl口另加霉索l(30U/rot)和链霉豢【100ml1-JCZ24h后换液川D-Hanks液冼胞2至3墟.除去未蚺壁斟H胞l残的
9、黏等.抉新鲜的培养液.25-瓶每瓶3ml寿右继续培养啦后23灭按液次待细胞约80%左右jr=时进行f纠,浊叁肌文献稍简化用DI1洲液荡洗细胞2趟%甲醇一2o定5min.审温l,晾T.20仔备川免牲蜘盥化学sl1浊按厂采的说l1址行4微管的免疫菠光愉删:细胞爬H同庄(甲醇-r加imm,I/LEG1A)如上述l睨爬JPB8执片5%8SA/02%rx.宰温下封州30rain:吸卉封渣,I封闭渡稀祥的一抗(伉一骨蛋I,l:100).4过1堇;PB8,先片.加封闭液稀释的nT(标记抗鼠I150)Cy3标卡抗龟IgG(1:200),室F孵肯1h;洗片.加PB5稀释的1/m1H,e,hst33258染15m
10、.PBs洗23遍,lBs廿油(plI9(1)判片.Oiymp.sX70菠光罹微镜观察和拙腭.用8Phor.shop70编辑性像5瞬时转和活细胞内荧)t自表选的观察:用Lipofeetamlne2000(I17200(I)世转气过上虚绑胞的转染罄照厂家蜕叫雨jnkr等法梢加改进细胞控种密度约8xl0/(ln.1R一20h80%冶ul世行转染.转染混台物g8lJ皿孵育们时间为6h庄I2扎板中每孔用3JL2000转约08I,EGFPEL24h枉荧光硅融镜下观察舰察前30min将【l-糟培养液换由尤酚红的OptiMEM加2%胎牛hf同州加Hh33258王终浓度为5nl以染细胞馈=一站】措气过I皮l胞的
11、啦定刚分离下水的气道f止细胞r-T相同肜,短幢J或钮门状等.1些成小或成片有nf蔚到帙迪的纤毛拱动脞12h庄右可细胞蚰壁.24h左右大部分蛐壁细J胞已先铺展.随詹l厝成盥的”自fI胞岛”(1,2)jt泉们浮晌卸Il描f大多数韧始接种的细胞)坫率不能再贴传代EGFP主要表诂于胞质和细胞桉山(56)什计转挚敬率为12%左右雹口1.2将C值应细胞盎&舶自袁低倍础lK龟痉化学删sP中倍一目3.4精气逋L嫂细胞Il龇臂妾自的表n骨蠡抗悼馓管H3258细胞椽商倍放太一I目8,6猜气J细胞巾E(=:rP走JIthst33258咐?1,qff放l细胞米源标水的瞳摊:川尽口fB新鲜浩白晌立气管标本一般在
12、j肴基后小超吐5h,通常34n_如果能将标小冷旌(4).f遗当越过谜十时限,但胜不超过24h此外,较小的H分离的L应细胞存活率常较高2染在古有青链礞索和一忡霉索n的缓?【l|漶进衍充分冲洗和浸泡立气管腔尽量除去腔内的血块,黏渣和杂物,睫用于收集细胞帕培箨谁也盥古抗棠洗和珏治的时间不p于30rain按照这样严格.发生染的机会诎少,f_且完仝培养诚里nTH抗面菌的药物3悄化方汝和时坷:l外分离t遭L皮细胞常用冷消化(4t消化16Ii以上)我J也竹尝试过.发班口得到较多的卸l胞,fI1-1;I胞的活力傲有咐增力._fl且容易污染我们来用37:轻缓摇动消化40,nin左右.这样愠十分离过大约3h:粜需
13、差较多自II胞.町延K消化时生284细胞接种密度和f代:j帷小圆形细胞仔活牢较高也有绑胞H成片壁如】曩细胞状志好(形,短憧堠或短杆状为主.纤毛摆动).通常Io/cm密艇P,II吖当细胞大部丹沉F后.瓶底有较密集的细胜但细胞闸仍一定的阃中华病卿学杂志2005年1O月第34卷第1O期ChinJPathol,October2005,V0l34,No.10隙.偶尔分离的细胞大部分呈细长的棒状,无纤毛摆动,一片死寂,这样的细胞难以存活,不要接种.此种情况可能与标本有关.至于传代,一般消化时间为10min左右,视细胞汇合度而异.由于消化液中酶的浓度较低,消化至20min左右通常不会对细胞活性有太大影响.本
14、文介绍的方法由于瓶中液体很少,必须在培养箱中消化.5.培养液:我们的配方里有血清.既往认为血清会抑制体外培养的人和某些动物的气道上皮细胞的生长,国外多年前即开始用无血清培养川.我们没有发现血清的抑制作用,相反的尚不能撤去血清.另外,目前我们培养的细胞仅能够传一代,再传细胞通常生长差.这些都需要进一步改进.细胞骨架与细胞的许多生物学过程密切相关,如微管参与细胞内蛋白的运输,细胞的运动和分裂等,与气道上皮细胞损伤修复关系密切.我们结合文献的方法能很好地显示微管骨架.另外,原代细胞的脂质体转染效果常常不能令人满意,尤其是气道上皮细胞,由于存在极性,表面的纤毛,糖化合物,分泌的黏液等妨碍DNA/J质体
15、复合物与细胞膜的接触和内吞,以及溶酶体对外源DNA的破坏等,影响脂质体转染效率.我们在猪气道上皮细胞中转染EGFP,可达到10%以上的转染效率,转染其他质粒则效率要低些,而且不同次分离的细胞转染效率也有差异,不过能满足某些实验的需要.从文献上看,目前国外已有成熟的原代气道上皮细胞分离培养的方法,细胞和培养液均已商品化,但国内相对欠缺.?687?培养猪的气道上皮细胞,标本来源广,便宜,分离细胞数量多,易于接种,是一种值得推荐的方法.同时,我们的实践对其他动物气道上皮细胞的培养也是有益的借鉴.参考文献1WuR,YankaskasJ,ChengE,eta1.GrowthanddifferentiationofhumannasalepithdiMcellsinculture.Serumfree,hormonesuppleme
