液体配制及实验方法

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1、一）液体配制1. 完全培养基DMEM+1O%FBS+1%双抗 + （1%HAPS 液）若放置时间长于2 周 加 1%谷氨酰胺2. PBS1000ml 去离子水中溶解 8.0gNaCl、 0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO43. 胰酶用之前调节PH值至7.64. CaCl2将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液每5ml胶原酶中加入100p l CaCl2溶液（终浓度3p mol/L）用于激活胶原酶的活性5. 双抗终浓度：青霉素100万U/100ml 链霉素 100万U/100ml青霉素0.6p g为1个单位 链霉素1.2195g为一个单

2、位称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中 再定容至100ml6. 两性霉素 B100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成浓度为2.5mg/ml（1000X）的浓缩液每100ml完全培养基中加入100p l浓缩液，稀释为终浓度2.5p g/ml7. 细胞冻存液20%DMSO+80%FBS（1mlDMSO+4mlFBS）8 STZ 溶液STZ 溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中 混合两者制成10 毫升的溶解液.再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中制成浓度1%的STZ溶液，调节PH值 至

3、4.5，4避光保存，由于STZ水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕.9 油红 O原液：油红O 0.6g溶于异丙醇（99%）100ml。稀释液：油红 O 原液 20ml ，蒸馏水 20ml ，过滤后使用。10 茜素红称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS，调节PH值到7.2,过滤后使用.11 成骨诱导液配方：DMEM(H)+10%FBS+10mmol心3 -甘油磷酸钠+0.1 p mol/L 地塞米松+50mg/LVitC1) 3 -甘油磷酸钠分子量：216溶于水10mmol/L=216mg/100ml称取216mg3 -甘油磷酸钠粉末溶于100ml低糖完全培养基中2) 地塞米松分子量：3

4、92.5在无水乙醇中的溶解度为1mg/ml.0.1p mol/L=0.04mg/L将100mg地塞米松溶于100ml无水乙醇中 制成25000X的浓缩液每100ml低糖完全培养基中加入4p l地塞米松浓缩液3) VitC分子量176.1溶于水称取5mgVitC粉末溶于100ml低糖完全培养基中12 成脂诱导液配方：DMEM(L)+10%FBS+10p mol/L 地塞米松+200p mol/L 吲哚美辛+0.5mmol/L3-异丁基 -1-甲基黄嘌吟(IBMX) +10mg/L胰岛素1) 每100ml高糖完全培养基中400p l地塞米松浓缩液2) 吲哚美辛分子量：357.79在无水乙醇中的溶解

5、度为1g/50ml PH 7.4以下 0.2mmol/L=7.16mg/100ml称取720mg吲哚美辛粉末溶于50ml无水乙醇制成200X的浓缩液每100ml高糖完全培养基中加入500p l吲哚美辛浓缩液3) IBMX 分子量：222.25 在 DMSO 中的溶解度为 1M(222.25mg/ml) 0.5mmol/L=1.1mg/100ml将 100mgIBMX 粉末溶于 1mlDMSO 制成 100mg/ml(9100X)浓缩液每100ml高糖完全培养基中加入11p lIBMX浓缩液4) Insulin 浓缩液浓度为 10mg/ml(1000X)每100ml高糖完全培养基中加入Insul

6、in浓缩液100p l.溶解粉末时均需先用少量液体溶解，再定容。二）细胞培养1骨髓基质干细胞（BMSC）、脂肪基质干细胞（ADSC）的原代培养1）准备工作所需液体：培养基，血清（FBS）,胶原酶消毒（器械、烧杯、滤纸、离心管等）（PBS,枪头，青瓶和塞子，5套器械+34个烧杯+ 滤纸，离心管 50+15ml）水浴锅调节温度至 37预热配制BMSC清洗液 将PBS倒入50ml的烧杯中加2%双抗和200ul两性霉素配制ADSC清洗液由于脂肪组织易污染，故将清洗液装入青瓶中，每100mlPBS加2% 双抗和 2040ul 两性霉素配制骨髓冲洗液（PBS+3%FBS）即300ul血清BMSC冲洗液及胶

7、原酶可放入37度水浴锅或温箱中预热2）取组织将SD大鼠（4周60-80g）引颈处死，用75%酒精浸泡5-10分钟 取大鼠内脏脂肪，取脂肪时剪开皮肤及剪取脂肪分别用两套器械减少污染，将取好的腹 部脂肪放入事先配制好的青瓶清洗液中取大鼠长骨，尽量将附着的肌肉剔除干净，若骨头断裂髓腔暴露，污染可能性大，弃之。 将取出的脂肪及骨头分别在清洗液中清洗3-5次3）收集细胞ADSC:将清洗后的脂肪组织在广口小青瓶中剪碎，加入适量II型胶原酶（每1ml脂肪 组织加1ml胶原酶）以及CaCl2 （200X）,将混合物移至15ml离心管中37 C 水浴30分钟（每间隔十分钟震荡15秒）,30分钟后将混悬液用细胞筛

8、网滤过， 并用终止夜（10%FBS的PBS） 2ml终止消化，收集液体至离心管，1500rpm离 心 5-6 分钟，弃上清重悬细胞，细胞计数并种入培养瓶中，加适量培养基，在培 养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期.BMSC：用器械剪去长骨两端，暴露骨髓腔，5ml注射器冲洗骨髓腔，收集液体至离心 管，1000rpm离心8分钟，弃上清重悬细胞，细胞计数并种入培养瓶中，加适 量培养基，在培养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期.2换液每 2-3 天一次，具体时间和频率根据细胞状态及培养基的颜色而定.准备物品：PBS、试管吸管步骤：吸出培养基， PBS 清洗 2 遍，再加入培养基. 原代细胞首次

9、换液时无需 PBS 清洗.3传代 原代细胞7天后传代，之后每2-7天传代，依据细胞密度及状态而定传代时根据细胞密度选择所传的瓶数，一般1 瓶90%融合的细胞可传2-4瓶.准备物品：15ml离心管、试管吸管、培养瓶、PBS、培养基、胰酶（ph调至7.4-7.6） 步骤：1）吸出培养基，用PBS清洗2遍（应彻底清除培养基，否则血清会影响胰酶的消 化作用）2）加3-5ml （75cm规格培养瓶）胰酶至培养瓶中，放入37 C水浴锅或培养箱中 消化 2-3 分钟，此过程中，显微镜下观察细胞形态由梭形变为圆形，立即加入 3-5ml培养基终止消化.3）用吸管轻柔吹打内壁数次帮助细胞脱落，也可用手轻拍瓶壁数下

10、，将细胞悬液 收集至离心管中， 1000rpm 离心 6-8 分钟4）沿细胞沉淀方向缓慢倾倒液体，加 1ml 培养基重悬，将重悬液分配至各培养瓶 中，再加入适量培养基，标记日期、代数.4.冻存准备物品：15ml离心管、试管吸管、冻存管、PBS、培养基、胰酶、冻存液、冰 步骤： 1）将冻存液及培养基冰浴，保持低温,2）如传代步骤中的1-3将细胞离心后，加入冰浴的培养基500p l重悬，移至冻存 管中3）在冻存管中加入等量冻存液，约550p l （一滴一滴地加入），混匀4）直接放入-80 C 冰箱（梯度降温效果不理想），过夜转入液氮罐5.复苏准备物品：37 C水浴锅、15ml离心管、培养瓶、培养基

11、 步骤：1）预热水浴锅（37 C）,在离心管中事先加入7-8ml培养基2）将冻存的细胞在37 C水浴锅中迅速地摇晃，使其快速溶解3）将1ml培养基加入冻存管中（一滴一滴地加入），混匀4）将冻存管中混匀的细胞悬液加入有培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟5）弃上清，用1ml培养基重悬细胞，种入培养瓶，加适量培养基，标记6. 细胞计数步骤： 1）细胞悬液的制备同前2）取细胞悬液15p l与等量0.08%胎盘蓝染液混合，将30p l混合液注入细胞计数板3）数出四个象限（各16 小格）的细胞总数后除以4，再乘以稀释倍数（一般细胞悬 液与染液是 1： 1 混合，故乘以2），最后乘以 104，即为细

12、胞数量7. 流式细胞检测前的样品制备准备物品：15ml离心管、1.5mlEP管、PBS、洗涤液（PBS+1%FBS）步骤： 1）将细胞消化、离心、去上清2）用洗涤液洗涤一次，加1ml洗涤液重悬，将细胞悬液分装至数个EP管中（数量 依据上机管数而定）3）继续用洗涤液将EP管中的细胞洗涤2遍，最后每管中加适量PBS重悬4）将所需抗体与PBS进行1： 1稀释，每EP管细胞悬液中加3-5p l相应抗体，保 留 1 管空白对照， 4 C 保存，待上机8. 流式细胞检测的抗体选择设置同型对照，也可设置双标（FITC/PE）1）CD29-FITC hamster IgG control2）CD45-FITC

13、 mouse IgG1 control3) CD44-FITC mouse IgG2a control4) CD34-FITC rabbit IgGcontrol9. 细胞爬片的制备准备物品：六孔板、盖玻片、离心管、PBS、胰酶、培养基 步骤：1）将第三代ADSC （数量约为2x104）制成细胞悬液1.8ml2）将消毒好的盖玻片放入六孔板中，每孔取300Ml细胞悬液平铺在盖玻片上3）待细胞贴壁后（约30分钟），每孔加入约3ml培养基10. 干细胞的诱导分化1）成骨诱导：ADSC（P3P5）制细胞爬片，待细胞70%融合后，将培养基换成成骨诱导液诱导,每 3 天换液，共诱导 21 天，之后进行茜素

14、红染色2）成脂诱导ADSC（P3-P5）制细胞爬片，待细胞70%融合后，将培养基换成成脂诱导液诱导,每3天换液，诱导21天，之后进行油红O染色11. 染色方法茜素红法 作用原理：利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。步骤： 1） 吸去诱导液，再 PBS 洗一到两次；2）加入 10中性甲醛，固定 30min-60min；3）吸去固定液，加入0.1%的茜素红染色液，染色6-10min；4）用 PBS 洗两次，去处残留的染色液； 结果：染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。油红O染色法作用原理：细胞在胞浆中不断有油滴的累积，并不断的增加变大，利用Oil Red O的油溶性 对油滴染

15、色。步骤： 1） 吸去诱导液，再 PBS 洗一到两次；2）加入10%中性甲醛，固定60min；3）吸去固定液，加入现配和过滤后的Oil Red O染色液，染色60min；4）用PBS洗2-5次，去处残留的染色液和残渣 结果：分化的脂肪细胞呈红色三）动物模型的建立免疫炎性1型糖尿病小鼠模型的建立采用小剂量多次STZ腹腔注射Balb/c 小鼠（6-8 周，22-25g）、1%STZ、40-60mg/Kg剂量连续五天注射步骤：1）小鼠禁食过夜2）次日清晨，甲紫溶液标记小鼠，测空腹血糖，称体重，计算所需药物剂量3）配制1%STZ溶液（方法件上文）4）1ml注射器抽取STZ对小鼠进行腹腔注射（注意注射器内因残留而损失的药物）重复上述步骤共五天在造模第三天进行第一次干细胞注射步骤：1）制细胞悬液，每只小鼠1X106细胞2）注射器抽取细胞悬液，用 5#或 4.5#头皮针对小鼠进行尾静脉注射，注射前75%酒 精消毒，注射后伤口涂红霉素软膏注意 ：小鼠尾静脉共4条，进针前绷直鼠尾，使静脉充盈，选择鼠尾下1/3 处毛鳞片较薄 部位，