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1、a -淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2005.4）试验全程安排：第一天样品的粗处理及粗分离，包括：1）样品处理2）离子交换色谱分离3）紫外检测（紫外测定蛋白），绘出色谱图4）收集样品第二天对各峰收集样品进行分析，包括：1）精确测定蛋白含量（Folin-酚）2）测定酶活3）比活计算第三天对活性峰及原液进行分析及鉴定，包括：1）SDS-PAGE分析（分子量分析）2）纯化倍数计算等试验一、色谱分离淀粉酶1.1试剂及设备离子交换树脂-20 C冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计a-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0, 0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓
2、冲液（平衡缓冲液+0.1M, 0.3M, 0.5M, 1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2离子交换色谱原理与方法色谱（chromatography）是一种分离的技术，随着现代化学技术的发展应运而生。20世纪 初在俄国的波兰植物化学家茨维特（Twseet）首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中， 植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就 可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。到1907年茨维特的论文用俄文公开发 表，他把这种方法命名为chromatography,即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。 但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的
3、人也不多，加之很快爆发了第一次世界大 战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方 法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。自20世纪40年代以来以Martin为首的 化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理 论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。20世纪 50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展， 亟需建立快速方便有效的石化成分分析。而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分 熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明
4、显、有效。同样，石化 工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。气相色谱的仪器也不断得到改进 和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。随着环境科学的发展， 不仅需要对大量有机物质进行分离和检测，而且也要求对大量无机离子进行分离和分析。 1975年美国Dow化学公司的H.Smal l等人首先提出了离子交换分离抑制电导检测分析思维 即提出了离子色谱这一概念离子。色谱概念一经提出便立即被商品化产业化由Dow公司组建 的Dionex公司最早生产离子色谱并申请了专利。我国从20世纪80年代开始引进离子色谱仪 器，在我
5、国八五、九五科技攻关项目中均列有离子色谱国产化的项目，对其进行了重点技术 攻关。色谱的分类色谱的分类有多种，主要按两相的状态及应用领域的不同可分为两大类1. 按应用领域不同分类制备色谱半制备色谱2. 以流动相和固定相的状态分类气相色谱、气固色谱、气液色谱、液相色谱、液固 色谱、液液色谱、超临界色谱、毛细管电泳离子交换色谱离子色谱分离主要是应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离 子。它在离子色谱中应用最广泛，其主要填料类型为有机离子交换树脂，以苯乙烯二乙烯苯 共聚体为骨架在苯环上引入磺酸基形成强酸型阳离子交换树脂，引入叔胺基而成季胺型强碱 性阴离子交换树脂，此交换树脂具有大孔或
6、薄壳型或多孔表面层型的物理结构以便于快速 达到交换平衡。离子交换树脂耐酸碱，可在任何pH范围内使用，易再生处理，使用寿命长。 缺点是机械强度差，易溶胀，易受有机物污染。离子色谱基本流程图如下图所示：离子交换的分类及常见种类（一）分类离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂根据其解离性大小， 还可分为强、弱两种，即强酸剂 阳离子交换剂 弱酸剂 强硷型 阴离子交换剂 弱硷 型。1. 阳离子交换剂阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和 酚羟基（-OH）等酸性基。某些交换剂在交换时反应如下：强酸性：R-SO3 -H+ + Na+
7、R-SO3- Na+H+弱酸性：R-COOH+Na+ R-COONa + H+国产树脂中强酸1×7 （上海树脂#732）和国外产品Dowex 50、Zerolit 225等都于强 酸型离子交换剂。2. 阴离子交换剂阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺N- （CH3） 2 和季胺-N （CH3） 2等俭性基团。某些交换反应如下：强硷性：R-N+ （CH3） 2 H·OH- +Cl R-N+ （CH3） 2 Cl+OH-弱硷性：R-N+ （CH3） 2 H·OH- +Cl R-N+ （CH3） 2 HCl+OH-强俭性#
8、201号国产树脂和国外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都属于强硷型阴离子交换剂。（二）种类1. 纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有氯代 三乙胺纤维纱（DESE-纤维素）。2. 交联葡聚糖离子交换剂：是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具 有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。常用的Sephadex 离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25，A-50 和 QAE- Sephadex A25， A50 ； 阳离子交换剂有 CM-Sephaetx C
9、-50， C-50 和 Sephadex C-25, C-50。阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数 字表示Sephadex型号。3.琼脂糖离子离交换剂：是将DESE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B上形成， DEAE-Sephades （阴离子）和CM-Sepharose （阳离子），具有硬度大，性质稳定，凝胶后的 流速好，分离能力强等优点。交换剂的处理，再生与转型新出厂的树脂是干树脂，要用水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有政绩一些杂质，所要 要用水、酸、硷洗涤。一般手续如下：1. 新出厂干树脂用水浸泡2小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子
10、水洗至澄清， 去水2. 加4倍量0.1-2N HCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性3. 再加4倍量0.1-2N NaOH搅抖4小时，除硷液，水洗到中性备用。4. 将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na+，则用4倍量NaOH 搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带H+，可用HCl处理。阴树脂转型也同样，若希望 带Cl-则用HCl，希望带OH-则用NaOH。再生：用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再一都用酸、硷液洗涤，往往只 要转型处理就行了。树脂保存方法使用过的树脂用大量的去离子水洗至中性后，放置于20%酒精中，4C冰箱保存。再次使用 时，需先用大量的去离子水洗至中
11、性，再用0.5N氧氧化钠和0.5N氯化钠处理0.5小时， 洗至中性即可使用。柱上操作交换剂装柱最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水 边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。装柱前应先在柱内保留1/3的缓冲液，并排除柱底部气泡，然后再倾入树脂。上样：向层析柱内倾入样品液洗脱与收集不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出 来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控 制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。1.3试验流程1.3.1粗酶液的制备将一定量的发酵酶
12、粉溶于醋酸钠或者磷酸盐缓冲液中，4衷泡12h，1X104r/min，4C 离心10分钟，弃去沉淀，收集上清夜进行分离。（备注：这一步骤已完成）1.3.2色谱柱的准备（装柱）按标准方法将离子交换树脂装填于色谱柱内，用平衡缓冲液平衡。1.3.3 a -淀粉酶的分离将一定量的样品溶液缓慢上入色谱柱内，先后用平衡缓冲液和洗脱缓冲液洗涤，每隔2 分钟收集一次样品，每个样品检测280nm的吸光值，绘出色谱曲线。将每个峰的样品集中起 来，以备酶活和蛋白质含量的测定。（备注：具体操作步骤及上样量以ppt课件为准）试验二、a-淀粉酶的活性测定及比活计算1.1试剂及设备3,5二硝基水杨酸试剂（DNS）葡萄糖标准液
13、（10mg/ml）福林试剂淀粉溶液（10mg/ml）磷酸盐缓冲液（pH6.0，0.02M）722型（或721型）分光光度计4 000r/min的离心机分析天平1.2原理与方法1.2.1 Folin-酚试剂测定蛋白含量Folin -酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质- 铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷 钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲 法高100倍，定量范围为5100p g蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱 氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和
14、巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白 质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。1.2.2淀粉酶活性测定淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉 经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括a -55淀 粉酶和8 -淀粉酶两种。a -淀粉酶可随机地作用于淀粉中的a -1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦 芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。8 -淀粉酶 可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催 化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3
15、-氨基-5-硝基水杨酸，其反 应式如下：淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲 线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生 成的麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中 主要是a -淀粉酶和8 -淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，a -淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅 速钝化。8 -淀粉酶不耐热，在70C15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝 化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化8 -淀粉酶，测出 a -淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（a -淀粉酶活力+8 -淀粉酶活力）， 再减去a -淀粉酶的活力，就可求出8 -淀粉酶的活力。1.3试验部分1.3.1 Folin-酚试剂测定蛋白含量（按ppt课件为准，以下仅供参考）1.3.1.1标准曲线的制作（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g结晶牛血清白蛋白，倒 入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗 数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250p g/mL的牛血清白 蛋白溶液。（2）系列
